Nghiên cứu hệ Protease trùn quế (Perionyx excavatus) trong quá trình tự phân và khả năng ứng dụng

cĩ thể xác định liều lượng thích hợp [61]. tPA tái tổ hợp và urokinase tuy khơng cĩ vấn đề miễn dịch như đối với streptokinase nhưng giá thành lại rất đắt. Do các tồn tại trên và nhu cầu chữa bệnh nghẽn mạch là rất lớn nên các nhà nghiên cứu đã tìm kiếm những tác nhân tự nhiên cĩ thể phân giải trực tiếp cục máu đơng gây nghẽn mạch, cĩ tác dụng thủy phân fibrin như plasmin cĩ trong cơ thể. Họ cho rằng enzyme thủy phân trực tiếp fibrin cĩ thể khắc phục được những vấn đề cịn tồn tại đối với các loại thuốc đã sử dụng. Do đĩ việc dị tìm các enzyme thủy phân trực tiếp fibrin làm thuốc chữa bệnh tim mạch đã tỏ ra cĩ nhiều triển vọng và ngày càng mở rộng trên nhiều đối tượng khác nhau từ nước tiểu ở người, động vật, thực vật cho đến vi sinh vật. 1.2.3.3 Các nghiên cứu về enzyme thủy phân fibrin Enzyme thủy phân fibrin cĩ nguồn gốc từ động vật: Lồi trùn đất Lumbricus rubellus đã được phát hiện tại Nhật [81], [82], cĩ khả năng thủy phân mạnh fibrin và sau đĩ được tinh sạch gồm 6 isozyme đều cĩ khả năng đĩ và được đặt tên là Lumbrokinase. Tiếp theo là các nghiên cứu trên lọai trùn này ở Hàn Quốc [46], [47] cũng đã tinh sạch, khảo sát các đặc điểm, giải trình tự nucleotide và nhân dịng gen mã hĩa lumbrokinase cĩ hoạt tính thủy phân fibrin cao. Năm 1997, Yang J.S đã tách chiết enzyme thủy phân fibrin được hoạt hĩa bởi SDS cĩ nguồn gốc từ lồi trùn đất Eisenia fetida [112]. Bằng các kỹ thuật sắc ký trên gel DEAE sepharose, sephadex G-75 và phenyl sepharose đã tinh sạch được loại enzyme cĩ khối lượng phân tử 45kDa gồm hai tiểu đơn vị, tiểu đơn vị lớn 26kDa và tiểu đơn vị nhỏ 18kDa gắn kết với nhau bằng các liên kết tương tác kỵ nước. Enzyme thủy phân fibrin được tách chiết từ sâu bướm Lonomia achelous ở Venezuela bởi Coll-Sangrona. E và ctv (1998) [52] cĩ hoạt tính khoảng 100 đơn vị urokinase/mL. Enzyme này cĩ khả năng phân hủy các cục máu đơng với tốc độ chậm hơn so với sự thủy phân của plasmin. Các vị trí cắt của enzyme này trên phân tử fibrinogen khác với các vị trí cắt của plasmin. Dametto và ctv, năm 2000 đã tinh sạch được enzyme giống trypsin cĩ khả năng thủy phân fibrin từ một giống ruồi Haematobia irrtans. Bằng cột sắc ký ái lực chuyên biệt 17 SBTI-sepharose đã tách được enzyme cĩ khối lượng phân tử 25,5 kDa hoạt động ở pH tối ưu bằng 9 và thủy phân được cơ chất tổng hợp H-D Ile-Pro-Arg-p-nitroanilide đặc trưng cho enzyme giống trypsin và cĩ thể thủy phân cả fibrinogen và fibrin với hoạt tính rất cao [93]. Enzyme thủy phân fỉbrin từ vi sinh vật: Năm 1987, Sumi sau nhiều năm nghiên cứu về enzyme phân giải cục máu nghẽn và tìm kiếm tác nhân tự nhiên cĩ thể hịa tan cục nghẽn liên quan đến nhồi máu cơ tim đã phát hiện ra nattokinase cũng là một enzyme cĩ khả năng thủy phân fibrin mạnh. Nattokinase được chiết tách và tinh sạch từ đậu nành lên men cĩ tên gọi Natto, là một lọai thực phẩm truyền thống của Nhật Bản. Quá trình lên men được bổ sung vi khuẩn Bacillus natto vào dịch đậu nành đã được nấu chín và chính lọai vi khuẩn này sản sinh enzyme nattokinase [114]. Tiếp theo là hàng loạt các nghiên cứu trên đối tượng vi sinh vật ở Hàn quốc, Kim W.K và ctv (1996) đã tinh sạch enzyme thủy phân fibrin từ Bacillus sp CK 11-4 được chiết tách từ nước sốt đậu nành lên men [75]. Một nghiên cứu khác của Kim H.K và ctv cũng tinh sạch và khảo sát các đặc điểm thủy phân fibrin từ Bacillus sp KA38 cĩ nguồn gốc từ cá muối lên men [73]. Douchi là loại thực phẩm lên men từ đậu nành Trung Quốc cũng được Wang và ctv (2006) đã chiết tách và xác định các tính chất một enzyme thủy phân mạnh fibrin và fibrinogen từ chủng Bacillus subtilis DC33 cĩ khối lượng phân tử khoảng 30kDa, với hoạt tính 418 IU cho mỗi ml mơi trường nuơi cấy LB [117]. Một enzyme thủy phân fibrin cĩ tính chất giống chymotrypsin thuộc nhĩm protease kim loại, bị kìm hãm bởi EDTA và EGTA cũng được phát hiện bởi Park và ctv năm 2007, tinh sạch từ mơi trường lên men nấm Flammulina velutipes [90]. Enzyme thủy phân fibrin cĩ nguồn gốc từ thực vật: Việc nghiên cứu các enzyme cĩ hoạt tính thủy phân fibrin cao khơng chỉ dừng lại ở các đối tượng động vật và vi sinh vật mà cịn khai thác cả trên thực vật. Choi và Sa (2001) đã tách chiết và khảo sát đặc tính của enzyme thủy phân fibrin từ lồi bèo tấm Spirodela polyzhira là loại enzyme cĩ hai sợi polypeptide với khối lượng phân tử 145kDa và 70kDa. Với khả năng thủy phân được khơng những cơ chất fibrinogen, fibrin mà cịn cĩ hoạt tính kháng thrombin. Vì vậy cĩ thể sử dụng trong điều trị lâm sàng đối với bệnh nghẽn mạch [53]. Kim J.S và ctv (2006) 18 đã tinh sạch enzyme protease trung tính từ loại nấm ăn chữa bệnh Cordyceps militaris (Hàn Quốc) với khối lượng phân tử 52 kDa cĩ khả năng thủy phân nhanh mạch α, mạch γ-γ của fibrin và thủy phân mạch β fibrin nhưng chậm hơn [14]. Như vậy với vai trị quan trọng của nhĩm enzyme thủy phân fibrin trong điều trị bệnh tim mạch nên việc tinh sạch và khảo sát các đặc tính hĩa học của nĩ trên các đối tượng khác nhau là điều cần thiết. Qua đĩ đã chứng minh được việc sử dụng các lồi trùn đất trong các bài thuốc dân tộc ở phương ðơng nĩi chung và Việt Nam nĩi riêng để ngăn ngừa và điều trị bệnh tim mạch là hồn tồn cĩ cơ sở khoa học. 1.2.4 Ứng dụng protease trong quá trình tự phân protein 1.2.4.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến qúa trình tự phân Quá trình tự phân của trùn quế thực chất là quá trình thủy phân protein trùn quế dưới tác động của hệ enzyme protease nội sinh. Vì vậy các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tự phân cũng chính là các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng cĩ enzyme xúc tác. Thơng thường các yếu tố này bao gồm pH, nhiệt độ, nồng độ enzyme và cơ chất, lượng nước bổ sung, thời gian thủy phân và diện tích tiếp xúc.
Ảnh hưởng của pH lên quá trình tự phân pH ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính enzyme do liên quan đến sự tương tác giữa enzyme và cơ chất. Phản ứng xúc tác phụ thuộc vào điện tích phân bố trên cả enzyme lẫn cơ chất, cụ thể là trung tâm hoạt động của phân tử enzyme. Mỗi enzyme chỉ hoạt động mạnh nhất ở một pH xác định, gọi là pH tối ưu. pH tối ưu cho hoạt động của nhiều enzyme vào khoảng 7. pH quá cao hay quá thấp cĩ thể làm enzyme bị biến tính. pH tối ưu của mỗi enzyme cĩ thể thay đổi trong một khoảng nhất định tùy theo tính chất và nồng độ cơ chất, nhiệt độ và bản chất của các loại dung dịch đệm [4].
Ảnh hưởng của nhiệt độ lên quá trình tự phân Bản chất của enzyme là protein do đĩ nhiệt độ cĩ ảnh hưởng rất lớn đến vận tốc phản ứng. Nhiệt độ tăng tốc độ phản ứng tăng nhưng đến mức nào đĩ thì tốc độ phản ứng giảm xuống do enzyme bị biến tính. ða số enzyme cĩ nhiệt độ tối ưu khoảng 40 - 50°C. Ở nhiệt độ trên 70oC phần lớn các enzyme đều mất hoạt tính. Nhiệt độ tối ưu của các enzyme khác nhau thì khơng giống nhau, chúng tùy thuộc vào nguồn gốc sản sinh ra 19 chúng. Phần lớn nhiệt độ tối ưu của enzyme từ vi sinh vật, thực vật cao hơn động vật [24]. Nhiệt độ tối ưu của mỗi enzyme khơng cố định mà thay đổi theo thời gian thủy phân, nồng độ enzyme, cơ chất phản ứng và dạng tồn tại của enzyme [4].
Ảnh hưởng của nồng độ enzyme và cơ chất trong quá trình tự phân Trong trường hợp cơ chất đầy đủ, nồng độ enzyme tăng sẽ làm tăng tốc độ phản ứng [18]. Nhưng nếu tăng nồng độ enzyme cao quá sẽ khơng cĩ hiệu quả kinh tế, ngược lại nếu cơ chất quá nhiều sẽ ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng enzyme. Vì vậy cần nghiên cứu chọn nồng độ enzyme phù hợp với lượng cơ chất nhất định. Trong quá trình tự phân đơi lúc sản phẩm sinh ra cũng cĩ thể ức chế hoạt động của enzyme, làm cho phản ứng xảy ra chậm và ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm [109].
Ảnh hưởng của lượng nước bổ sung trong quá trình tự phân Trong phản ứng thủy phân protein bằng enzyme, nước khơng những là mơi trường để khuếch tán enzyme và cơ chất mà cịn là tác nhân tham gia phản ứng. Lượng nước cho vào nếu ít quá thì tác dụng thủy phân của enzyme kém nhưng nếu nhiều quá thì sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật hoạt động làm ảnh hưởng đến chất lượng của dịch đạm thủy phân. ðối với quá trình tự phân trùn quế để sản xuất bột đạm amine thì lượng nước bổ sung ngồi ảnh hưởng đến việc tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất cịn ảnh hưởng đến quá trình sấy khơ sản phẩm, vì vậy cần nghiên cứu để chọn được tỷ lệ nước bổ sung thích hợp là cần thiết.
Ảnh hưởng của thời gian tự phân Theo một số nghiên cứu thì mức độ thủy phân tăng vọt trong thời gian đầu của phản ứng, sau đĩ tốc độ phản ứng chậm lại. Thời gian thủy phân dài hơn, cần sử dụng lượng enzyme lớn hơn thì mức độ thủy phân mới cĩ thể cao hơn. Thời gian thủy phân nhanh hay chậm cịn phụ thuộc vào nhiều yếu tố như kích thước nguyên liệu, cấu trúc, loại protein …
Ảnh hưởng của diện tích tiếp xúc Diện tích tiếp xúc cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình thủy phân. ðể tạo điều kiện tốt hơn cho quá trình thủy phân cần tăng khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất, muốn vậy cần làm nhỏ kích thước cơ chất trước khi thủy phân. 20 Như vậy cĩ nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân trùn quế bằng phương pháp sử dụng protease nội sinh, vì vậy cần phải phối hợp hài hịa giữa các yếu tố giúp qúa trình tự phân đạt hiệu suất cao nhất nhằm tạo bột đạm đạt chất lượng cao về hàm lượng đạm amine và cả độ an tồn về mặt vi sinh thực phẩm. 1.2.4.2 Các phương pháp đánh giá hiệu suất quá trình thủy phân protein Trong quá trình thủy phân protein thơng số theo dõi phản ứng là hiệu suất thủy phân. Hiệu suất thủy phân được xác định là % của lượng nitơ đạm amine tạo ra trong dịch thủy phân trên lượng nitơ của đạm tổng số [79]. MN x100 Trong đĩ : Hiệu suất thủy phân (N%) = MN tổng số N: hiệu suất thủy phân (%) MN: lượng nitơ đạm amine dịch thủy phân MN tổng số : lượng nitơ đạm tổng số Một vài phương pháp thơng dụng để theo dõi hiệu suất thủy phân là pH-stat, chuẩn độ formol, đo độ nhớt, xác định hàm lượng nitơ hịa tan hoặc xác định hàm lượng nhĩm amine bằng phương pháp Trinitro-benzene sulfonic acid (TNBS) hoặc phương pháp ortho-phthaldialdehyde. Mỗi phương pháp đều cĩ những ưu và nhược điểm khác nhau, những phương pháp xác định nhanh cĩ thể cho độ chính xác khơng cao. Sau đậy là bảng tĩm tắt nguyên tắc các phương pháp xác định hiệu suất thủy phân protein thơng dụng. Bảng 1.2 Nguyên tắc các phương pháp xác định hiệu suất thủy phân Phương pháp Nguyên tắc Tham khảo pH-stat ðo độ nhớt Chuẩn độ formol TNBS OPA Giữ pH khơng đổi suốt tiến trình thủy phân, số lượng base sử dụng tỉ lệ với lượng amine tạo ra Theo dõi sự thay đổi độ nhớt bằng máy đo độ nhớt Chuẩn độ nhĩm amine với formadehyde 2,4,6-Trinitro-benzene sulfonic acid phản ứng với nhĩm amine tạo hợp chất cĩ màu Ortho -phthaldialdehyde phản ứng với nhĩm amine bậc 1 tạo hợp chất hấp thụ ở bước sĩng 340nm [86] [86] [79] [88] [87] 21 1.3 Kỹ thuật thu nhận, tinh sạch và phân tích protein hiện đại Protein là hợp chất hữu cơ cao phân tử, do tế bào sống tổng hợp nên và hoạt động tốt trong mơi trường cơ thể chính nĩ. Trong thực tế để ứng dụng protein cĩ hoạt tính sinh học một cách hiệu quả, chẳng hạn đối với protein là enzyme do chúng khơng những xúc tác cho các phản ứng xảy ra trong hệ thống sống mà sau khi tách khỏi nĩ vẫn cĩ thể hoạt động cho các phản ứng ở ngồi tế bào. Vì thế việc tinh sạch protein nhằm hiểu rõ hơn về tính chất lý hĩa học của nĩ như khối lượng phân tử protein, nhiệt độ và pH tối ưu, độ bền pH, nhiệt độ theo thời gian, các tác dụng sinh lý trên invitro là điều khơng thể thiếu trong các nghiên cứu cơ bản. Ngày nay, với sự phát triển các thiết bị và kỹ thuật tiên tiến giúp cho các phương pháp phân tích, tinh sạch những hợp chất cĩ phân tử lượng lớn ngày càng trở nên dễ dàng hơn. ðặc biệt trong lĩnh vực tinh sạch protein với hàm lượng nhỏ được thực hiện, ngồi ý nghĩa trên chúng cịn được nghiên cứu sâu hơn về sự biến đổi sau giải mã và chức năng sinh học của protein [107]. Các protein cĩ hoạt tính sinh học sau khi tinh sạch sẽ được thủy phân bằng các enzyme cắt đặc hiệu. Sau đĩ dùng kỹ thuật sắc ký tách các đoạn peptide và giải trình tự amino acid các đoạn peptide này theo phương pháp Edman. Hiện nay việc phân tích này cĩ thể tiến hành nhanh hơn với lượng mẫu phân tích rất nhỏ nhờ phương pháp phổ khối lượng MS-MS hoặc MALDI-TOF. Tiếp theo việc xác định này là giải trình tự nucleotide của đoạn gen mã hĩa cho đoạn peptide trên, tiến xa hơn nữa là sản xuất enzyme, kháng thể, vacxin… bằng con đường cơng nghệ sinh học. Bên cạnh đĩ, việc tinh sạch protein để nghiên cứu cấu trúc khơng gian ba chiều dạng tinh thể bằng kỹ thuật X-Ray nhằm xác định mối quan hệ giữa chức năng và cấu trúc phân tử protein hoặc cơ chế xúc tác của enzyme cũng là một trong những vấn đề hiện nay được các nhà khoa học quan tâm. Như vậy một nghiên cứu cơ bản về tinh sạch protein cần đi theo trình tự các bước từ thu nhận, tìm kỹ thuật tinh sạch, kiểm tra hoạt tính, xác định các đặc tính hĩa học và phân tích sâu hơn là trình tự amino acid….Trong mỗi bước cần phải chú ý đến các điều kiện và kỹ thuật cụ thể để thu được một protein cịn hoạt tính sinh học, cĩ độ tinh sạch cao. 22 1.3.1 Thu nhận và xử lý mẫu 1.3.1.1 Nguyên liệu Protein được tinh sạch rất đa dạng bao gồm các protein hịa tan, protein màng hoặc protein vách tế bào ở dạng liên kết cộng hĩa trị. Ngồi các nguyên liệu từ mơ động thực vật và vi sinh vật hoang dại, cịn cĩ các vi sinh vật được tạo ra bằng kỹ thuật di truyền hoặc các sản phẩm protein tái tổ hợp cũng là đối tượng được chiết tách và tinh sạch. Một số nguyên liệu cĩ thành phần protein hịa tan tương đối sạch như huyết thanh, nước tiểu, nọc rắn, hoặc mơi trường ngoại bào từ việc nuơi cấy vi sinh vật đều thích hợp cho việc đưa trực tiếp vào cột sắc ký sau khi ly tâm, lọc hoặc cĩ thể cơ đặc trước khi qua cột tinh sạch. Tuy nhiên, trong hầu hết các trường hợp, nguyên liệu lấy trực tiếp từ mơ động thực vật, protein màng hoặc vách tế bào thì các thành phần khác sẽ gây khĩ khăn cho việc chiết tách. Các khĩ khăn thường gặp khi chiết tách một protein là sự biến tính, sự tự thủy phân và các tạp chất cĩ trong mẫu phân tích như chất màu, acid nucleic, vi khuẩn… Tuy vậy, trong một số trường hợp cũng cĩ thể giảm bớt một số vướng mắc trên bằng cách rút ngắn thời gian chuẩn bị và chiết tách ở nhiệt độ thấp. Thời gian chuẩn bị càng nhanh càng tốt và ở nhiệt độ thấp nhất nếu cĩ thể, đồng thời tìm mọi biện pháp để loại bỏ các tạp chất cĩ trong mẫu là điều cần thiết [51]. 1.3.1.2 Một số thiết bị nghiền mẫu và phá vỡ tế bào dùng trong chiết tách mẫu * Phá vỡ các mơ mềm: + Máy nghiền đơn giản, thiết bị đồng hĩa mẫu hoặc thiết bị nghiền mẫu potter. * Phá vỡ các mơ cứng : thường là các loại hạt, chúng được ngâm trong nước hoặc dung dịch đệm. Sau đĩ nghiền bằng cối xay hoặc cối chày thơng thường. ðơi khi cũng cĩ thể nghiền trực tiếp trong nitơ lỏng. * Vi khuẩn hoặc nấm men: + Phá vách tế bào bởi protease, dùng sĩng siêu âm hoặc sử dụng áp suất [101]. 1.3.1.3 Các yếu tố cần chú ý khi chiết tách protein Dung dịch đệm pH: pH cĩ ảnh hưởng rất lớn đến cấu trúc khơng gian của protein, vì thế nĩ cũng ảnh hưởng đến chức năng sinh học của các phân tử này. Thơng thường giá trị pH sử dụng sao cho protein cĩ hoạt tính tối đa. Tuy vậy đĩ cũng chưa phải là giá trị pH 23 cho hiệu quả chiết tách tốt hoặc ổn định nhất. Ví dụ trypsin hoạt động tốt nhất ở pH 8-9 nhưng nĩ lại ổn định ở pH 3, vì tại giá trị pH này sự tự hủy cĩ thể được tránh khỏi. Việc sử dụng pH khắc nghiệt đơi lúc cũng rất hiệu quả và cũng được chấp nhận cho một vài trường hợp nếu như khơng gây biến tính protein. Hầu hết protein được hịa tan tốt ở lực ion vừa phải khoảng 0,05 – 0,1M. Một dung dịch đệm cĩ khả năng chấp nhận được lấy trong phạm vi một đơn vị pH từ giá trị pKa được cho [51]. Tác nhân khử Hiệu thế khử của tế bào chất thường thấp hơn mơi trường xung quanh nơi thường cĩ mặt của oxy khơng khí, những protein nội bào thường lộ ra những nhĩm thiol và chúng cĩ thể bị oxy hĩa trong tiến trình tinh sạch. Những nhĩm này được bảo vệ bởi các tác nhân khử như 1,4-dithioerythritol (DTE); 1,4-dithiothreitol (DTT) hoặc β-mercaptoethanol với nồng độ 10-25mM đủ để bảo vệ nhĩm thiol khỏi bị khử thành các cầu disulfit nội phân tử [51]. Ion kim loại – phức càng cua (chelator) Sự cĩ mặt các ion kim loại nặng cĩ thể gây bất lợi đến hoạt tính sinh học protein. Chúng làm tăng sự oxy hĩa nhĩm thiol bởi các phân tử oxy, hoặc cĩ thể tạo phức với các nhĩm chuyên biệt và gây ra nhiều vấn đề phức tạp. Kim loại nặng cĩ thể kết hợp chặt chẽ với các tác nhân tạo phức càng cua, đặc biệt là ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) nồng độ 10-25mM. Tuy nhiên cần chú ý EDTA cũng là một dung dịch đệm, vì thế tốt nhất là thêm dạng muối cĩ 2 natri trước khi điều chỉnh pH cuối cùng. Khả năng tạo phức càng cua sẽ gia tăng khi pH tăng. Một số protein được ổn định bởi các ion kim loại hĩa trị 2 như Ca2+. Mg2+, nhưng chúng sẽ tạo phức càng cua với EDTA vì thế cần tránh sử dụng chung [51]. Chất ức chế sự phân giải protease Một yếu tố thường ảnh hưởng đến sự ổn định protein là sự phân giải bởi chính các protease cĩ mặt trong mơi trường chiết tách. Biện pháp an tồn nhất để giảm bớt sự phân giải protein là làm việc nhanh trong điều kiện lạnh, hoặc thêm các chất kìm hãm protease vào dung dịch đệm chiết tách. ðối với các protease thuộc nhĩm serine và kim loại cần 24 bổ sung các chất kìm hãm để giảm bớt khả năng này. Tuy vậy, các chất kìm hãm protease thường rất đắt, vì thế cĩ thể giới hạn sử dụng trong việc áp dụng quy mơ lớn [51]. Bảng 1.3 Các chất ức chế protease thơng dụng Chất ức chế protease Loại protease Nồng độ sử dụng PMSF Aprotinin Benzamidin Pepstatin A Leupeptin EDTA & EGTA Serine protease Serine protease Serine protease Acid protease Thiol protease Protease kim loại 0,1-1mM 5 µg/ml 1mM 1µg/ml 1 µg/ml 0,1-1mM Chất kháng khuẩn Tiến trình tinh sạch protein thường kéo dài, nên việc đề phịng sự phát triển vi khuẩn trong dung dịch protein là điều cần thiết. Biện pháp đơn giản nhất là sử dụng phễu lọc vơ trùng (sterli-filtered), điều này sẽ giảm bớt sự phát triển vi khuẩn trong cột sắc ký. Một cách khác nữa là tạo một dịng chảy tốc độ rất thấp liên tục qua cột ngay cả khi khơng sử dụng. Dung dịch đệm ở pH trung tính thường thích hợp cho sự phát triển vi khuẩn, vì thế ở pH đệm ≤ 3 và pH ≥ 9 cĩ thể ngăn chặn được điều này nhưng đơi lúc cũng dẫn đến sự phát triển của nấm mốc. ðiều kiện cho phép cĩ thể sử dụng tác nhân kháng khuẩn vào dung dịch đệm, thường sử dụng nhất là hợp chất azide 0,01mM, merthiolate 0,05% hoặc alcol n-butanol 1%. Hạn chế đối với hợp chất azide là cĩ khả năng gắn với kim loại, nên sẽ ảnh hưởng đến việc đo hoạt tính và tiến trình chạy sắc ký, tuy vậy nĩ vẫn thường được thêm vào để bảo quản dung dịch protein [71]. Ngồi ra, trong trường hợp chiết tách protein màng, các nhĩm kỵ nước thường gắn chặt vào màng tế bào và kết tụ thành khu kỵ nước. Vì vậy cần phải sử dụng các chất tẩy rửa hoặc tác nhân tạo phức càng cua để tách các nhĩm kỵ nước ra khỏi màng tế bào. Một vài chất khơng gây biến tính các protein hình cầu hoặc khơng ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học nhưng một số chất khác cĩ thể gây biến tính như SDS. Thơng thường chỉ sử dụng chất tẩy rửa cùng với dung dịch đệm ở giai đoạn chiết tách đầu tiên và khơng nên sử dụng ở nồng độ cao sẽ ảnh hưởng đến các tiến trình tinh sạch và phân tích sau này. 25 1.3.1.4 Tủa sơ bộ Hỗn hợp protein phức tạp sau khi chiết tách thường được kết tủa với các tác nhân gây tủa. ðây được xem là bước khởi đầu cho việc tinh sạch protein trước khi cho vào cột chạy sắc ký nhằm loại bớt tạp chất và cơ đặc protein. Kết tủa protein trong dung dịch chiết tách cĩ thể thực hiện bằng cách thêm muối, dung mơi hữu cơ, polymer hữu cơ hoặc thay đổi pH của dung dịch. Các tác nhân gây tủa thơng dụng và tính chất của chúng được trình bày ở bảng 1.3. Bảng 1.4 Tác nhân tủa protein thơng dụng Tác nhân Loại Tính chất Ammonium sulfate Natri sulfate Ethanol Aceton Polyethylen glycol Muối Muối Dung mơi Dung mơi Polymer Dễ tan , ổn định - Dễ cháy, dễ biến tính Dễ cháy, dễ biến tính Khơng tích điện Bước tiếp theo của tiến trình tinh sạch sơ bộ là ly tâm, được sử dụng thường xuyên trong phịng thí nghiệm để thu nhận kết tủa protein. Khi ly tâm cần chú ý đến nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính của các enzyme, thơng thường quá trình ly tâm được thực hiện ở nhiệt độ 4oC. 1.3.2. Các kỹ thuật sắc ký thường sử dụng trong tinh sạch protein Dựa trên các tính chất của protein cĩ thể tinh sạch bằng các kỹ thuật sắc ký khác nhau: + Sắc ký lọc gel dựa vào kích thước và khối lượng phân tử protein + Sắc ký trao đổi ion dựa trên khả năng tích điện protein trong mơi trường pH nào đĩ. + Sắc ký tương tác kỵ nước dựa vào các nhĩm kỵ nước trong phân tử protein + Sắc ký ái lực dựa trên khả năng gắn với các nhĩm chức năng chuyên biệt như tương tác giữa enzyme-cơ chất, enzyme-chất ức chế enzyme, kháng nguyên- kháng thể, DNA- protein. Mỗi kỹ thuật đều cĩ các yêu cầu khác nhau về cách chuẩn bị mẫu cho vào cột, dung dịch đệm pha mẫu, chọn lựa gel thích hợp, tốc độ dịng…[101]. Tuy nhiên, việc chọn lựa các kỹ thuật chạy sắc ký như thế nào để tinh sạch một protein hồn tồn chưa biết cịn tùy 26 thuộc rất nhiều vào đặc tính riêng biệt của loại protein đĩ. Khoảng 100 tiến trình tinh sạch protein thành cơng, mỗi tiến trình tinh sạch trung bình cần kết hợp khoảng 4 bước, hiếm cĩ protein nào duy nhất một bước tinh sạch ngay cả protein cĩ nhĩm chức năng chuyên biệt (Bonnerjea,1986 được trích bởi Jansson, 1998) [51]. Do đĩ, nếu hỗn hợp protein phức tạp ngồi bước tinh sạch sơ bộ cần phải kết hợp các kỹ thuật sắc ký khác nhau mới cĩ thể tách riêng được protein cần chiết tách. ðể đánh giá mức độ thành cơng của việc tinh sạch một protein, điều quan trọng nhất là chứng minh hoạt tính sinh học của nĩ vẫn hoạt động, cụ thể đối với enzyme là hoạt tính riêng của chúng sẽ được tăng lên qua mỗi bước tinh sạch khác nhau. Do vậy cứ qua mỗi bước tinh sạch cần xác định hoạt tính tổng và hàm lượng protein để tính hoạt tính riêng đặc hiệu. Kết thúc các bước của quy trình tinh sạch thu thập các số liệu, lập bảng tổng kết để qua đĩ sẽ đánh giá được hiệu quả của một tiến trình tinh sạch protein. Ngồi ra, qua mỗi bước tinh sạch cĩ thể kiểm tra độ tinh sạch thơng qua điện di đồ bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE. Theo Jansson (1998) việc cải thiện những dụng cụ tinh vi làm cho quá trình phân tích, tinh sạch protein ngày càng tốt hơn vì đơi lúc người ta xem việc tinh sạch protein là một nghệ thuật hơn là một ngành khoa học [51]. Quá trình đầu tư nghiên cứu một cách hiệu quả để tinh sạch một protein hoặc một hormon từ một tế bào chiết tách phải trải qua hàng tháng trời, tốn nhiều cơng sức và tiền của. Vì vậy, sự phát triển các kỹ thuật sắc ký, hệ thống sắc ký tự động, các kỹ thuật điện di mới, các hệ thống phân tích nhanh protein đã làm gia tăng hiệu quả đánh giá tiến trình và mức độ tinh sạch protein. Tiếp theo sau đây là các kỹ thuật điện di thường sử dụng để đánh giá mức độ tinh sạch protein sau khi qua các bước sắc ký hoặc trước khi phân tích trình tự các amino acid. 1.3.3 Kỹ thuật điện di 1.3.3.1 Kỹ thuật điện di SDS-PAGE Kỹ thuật này thường được sử dụng để xác định khối lượng phân tử và kiểm tra độ tinh sạch của protein sau quá trình tinh sạch. 27 Về nguyên tắc SDS-PAGE là kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi cĩ sự hiện diện của Sodium DodecylSulfate (SDS), đây là một tác nhân gây biến tính và làm âm tính hĩa các phân tử protein. Trong điều kiện nhiệt độ cao và sự cĩ mặt của β- mercaptoethanol hay dithithreitol (DTT) sẽ khử các cầu nối disulfide trong phân tử protein, khi đĩ các tiểu đơn vị protein trong hỗn hợp cĩ cùng mật độ điện tích sẽ cùng chạy trong một điện trường. Như vậy tốc độ di chuyển trong điện trường của protein phụ thuộc chủ yếu vào kích thước phân tử [68]. ðể xác định khối lượng phân tử của protein sau khi tinh sạch, protein chuẩn sẽ chạy cùng với mẫu trên cùng bản điên di. Khối lượng phân tử một protein chưa biết cĩ thể tính chính xác từ đường chuẩn bằng cách lấy log Mr với hệ số Rf của các protein chuẩn. Trong đĩ: Rf = Rp/RB Rp: Khoảng cách từ gel phân tích đến tâm điểm của từng băng protein chuẩn. RB: Khoảng cách từ gel phân tích đến vạch cuối của chất chỉ thị Mr: Khối lượng phân tử của các protein chuẩn 1.3.3.2 ðiện di hai chiều (2-Dimension Electrophoresis) Nếu protein cĩ cùng khối lượng phân tử sau khi tinh sạch được tách ra trên gel SDS- PAGE nhưng sự tích điện của chúng cĩ thể khác nhau và sẽ được tách tiếp tục ở điện di điểm đẳng điện thì chúng được xem là đồng đẳng của nhau. ðối với enzyme gọi là isozyme. Trong trường hợp này cần kiểm tra để xác định tiếp tục pI của protein bằng điện di điểm đẳng điện hoặc điện di hai chiều. ðiện di hai chiều là phương pháp tách protein hoặc acid nucleic trong mẫu phân tích thành các điểm theo hai hướng khác nhau trong cùng một gel [116]. Nĩ là sự kết hợp của kỹ thuật điện di điểm đẳng điện và điện di xác định khối lượng phân tử SDS-PAGE. Cả hai kỹ thuật này đều phụ thuộc vào những tính chất hĩa lý của protein như khả năng tích địên và khối lượng phân tử. Ưu điểm của kỹ thuật này là hàm lượng protein phân tích rất nhỏ (vài nanogam), cĩ thể phân tích hỗn hợp khoảng 1800 protein khác nhau trong cùng một gel [116] và là cơng cụ đầu tiên trong phân tích protein. Nhược điểm của phương pháp điện di hai chiều là việc xử lý mẫu, vì khĩ cĩ thể tách một hỗn hợp protein phức tạp với nhiều các đặc tính khác nhau. 28 Trong điện di hai chiều, điện di điểm đẳng điện sẽ được chạy bước đầu tiên, sau đĩ mới chạy điện di SDS-PAGE sau. ðiện di điểm đẳng điện (IEF) dựa trên cơ sở tách protein theo điểm đẳng điện của nĩ. Mỗi phân tử protein đều là các phân tử lưỡng tính, khả năng tích điện của chúng phụ thuộc vào pH mơi trường. Tại điểm đẳng điện pI protein khơng tích điện và khơng di chuyển trong điện trường. Thơng thường gel điện di IEF chứa gradient pH được làm từ các phân tử lưỡng tính (ampholite) như các amino acid hoặc dẫn suất của acrylamide CH2=CH-CO-NH-R với các gốc R cĩ chứa nhĩm carboxyl và nhĩm amine bậc ba. Các ampholite sẽ tạo một gradient pH từ thấp đến cao trên gel. Ở mơi trường pH > pI protein sẽ tích điện âm và pH < pI protein sẽ tích điện dương. Trong điện trường IEF, các protein tùy thuộc vào sự tích điện sẽ dịch chuyển về cực âm hay dương và ở giá trị pH = pI thì protein sẽ được dừng lại. 1.3.3.3 Phát hiện protein Sau khi hồn tất việc tách protein ở cả hai kỹ thuật điện di một hoặc hai chiều, các điểm protein cĩ thể phát hiện trong gel hoặc trên bề mặt một màng cố định. ðối với điện di hai chiều, hầu hết các điểm protein phát hiện trong gel theo phương pháp nhuộm bằng Comassie Brilliant Blue, hoặc thuốc thử bạc [72]. Ngồi ra cĩ thể phát hiện protein bằng hùynh quang, đây là thuốc nhuộm phức càng cua của kim loại Rubenium cĩ tên SYPRO Ruby cĩ tiện lợi là rút ngắn thời giạn nhuộm, độ nhạy cao hơn khoảng 1000 lần so với thuốc nhuộm bạc nhưng khơng ảnh hưởng đến các đặc tính hĩa học của các nhĩm chức, điều này rất cần thiết cho việc phân tích trình tự amino acid bằng phản ứng Edman và phương pháp phổ khối lượng. Sau đây là cơ sở lý thuyết và kỹ thuật phân tích protein để xác định trình tự amino acid bằng phương pháp phổ khối lượng hiện nay thường sử dụng trong các phịng thí nghiệm sau khi phân tích trực tiếp protein trên gel điện di 1.3.4 Phân tích protein bằng phương pháp phổ khối lượng 1.3.4.1 Giới thiệu về phổ khối lượng trong vịêc phân tích peptide và protein Trước đây, việc xác định trình tự amino acid của một phân tử protein rất phức tạp, đầu tiên sử dụng các enzyme cắt đặc hiệu, dùng kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp cho việc tách 29 peptide, sau đĩ xác định trình tự đầu N bằng phương pháp Edman. Phân tích theo phương pháp này rất tốn thời gian, hàm lượng protein cần cho phân tích khoảng 100pmol [93], đoạn peptide lớn hơn 50 amino acid sẽ cho độ chính xác khơng cao. Hiện nay, dựa trên sự cải tiến quá trình ion hĩa, việc phân tích protein bằng phổ khối lượng đã trở thành một cơng cụ đắc lực cho các ngành sinh học, sinh y học … Vì nĩ đáp ứng được các yêu cầu cơ bản trong phân tích sâu về protein khơng những ở việc xác định trình tự amino acid, mà cĩ thể đối phĩ với các protein ở dạng phức hợp với hàm lượng rất nhỏ. ðặc biệt cĩ khả năng xác định các biến đổi sau quá trình giải mã nhờ dãi phát hiện động học rộng, việc phân tích protein cĩ thể cho kết quả đáng tin cậy [91]. Cơ sở của phương pháp phổ khối lượng là sự bắn phá phân tử bởi các nguồn ion hĩa, chuyển các phân tử khơng tích điện thành các phần tử mang điện tích dương hoặc phá vỡ thành các mảnh ion, các gốc tự do bởi các phần tử mang năng lượng cao. Peptide và protein là những phân tử khơng ổn định bởi nhiệt. Vì vậy nĩ cần được thực hiện ion hĩa bằng phương pháp “mềm” để tạo ra các ion cịn giữ nguyên tính chất. Cĩ hai phương pháp thích hợp cho phân tích peptide và protein là ion hĩa hấp phụ bức xạ laser (Matrix- Assisted Laser Desorption Ionisation: MALDI) và ion hĩa phun điện (Electrospray Ionisation : ESI). Các phần tử tích điện và các gốc tự do sau khi được tạo thành sẽ được tách ra khỏi nhau theo số khối m/z nhờ bộ phận phân tích TOF (thời gian bay) hoặc các bộ phận phân tích bẫy khối tứ cực dùng trong thiết bị khối phổ hai lần MS-MS, vì thế sẽ xác định thật chính xác khối lượng phân tử của chúng [91]. 1.3.4.2 Các bước phân tích protein theo phương pháp phổ khối lượng Thu nhận các điểm protein trên điện di đồ sau khi chạy điện di một chiều hoặc hai chiều. Tiến hành phân cắt chúng bằng các enzyme đặc hiệu thành hỗn hợp các peptide, sau đĩ sử dụng kỹ thuật MALDI-TOF hoặc ESI-MS-MS để lập bản đồ khối lượng peptide kết hợp nghiên cứu dữ liệu trình tự protein khơng giới hạn NRDB (Non-redundant protein sequence database) trên website [118]. Quy trình trên được tĩm lược theo sơ đồ hình 1.8: Hình 1.8: Quy trình lập bản đồ phân tích protein theo phương pháp phổ khối lượng Mẫu phân tích Tách protein 1-DE or 2-DE Thủy phân protein Phân tích MS. Lập bản đồ peptid Nghiên cứu dữ liệu. Xác định protein 30 ðây là kỹ thuật hiện đại cĩ độ chính xác khá cao và tiện lợi về mặt tốc độ phân tích để xác định trình tự amino acid trong phân tử protein nên thường được áp dụng trong các phịng thí nghiệm hiện nay. Nếu đạt kết quả cĩ thể sử dụng để giải trình tự nucleotide và nhân dịng với gen tương thích. Chọn enzyme cắt: Chọn enzyme cắt tạo ra các peptide cĩ khối lương tương thích với phân tích phổ khối lượng MS và nghiên cứu dữ liệu để cĩ độ chính xác đích thực. Một vài tính chất chuyên biệt của enzyme được trình bày ở bảng 1.4: Bảng 1.5: Tính chất enzyme cắt chuyên biệt phân giải protein trong phân tích MS Protease Vị trí cắt chuyên biệt Phân tích MS Nghiên cứu dữ liệu Trypsin Cắt chọn lọc rất cao ở đầu C của Arg &Lys Tuyệt hảo, peptide tạo được cĩ kích thước 500-2500Da. Cĩ hạn chế tự phân hủy. Tốt, chỉ cĩ 2 amino acid phải xem xét cho đầu cuối C Lys-C* Cắt độc quyền ở đầu cuối C của Lys cĩ tính chuyên biệt cao Tốt. Peptide tạo ra khá lớn thích hợp cho nghiên cứu phosphopeptide. Khơng tự hủy. Làm việc với MS-MS bị ảnh hưởng các mạch nhánh Arg nội phân tử. Tốt, chỉ cĩ 1 amino acid phải xem xét cho đầu cuối C Glu-C** Phụ thuộc pH, cắt ở đầu C của Glu (pH4); Glu & Asp (pH7), khả năng cắt chuyên biệt trung bình Trung bình, tái tạo lại các peptide tự phân cắt. Làm việc với MS-MS bị ảnh hưởng các mạch nhánh Arg, Lys nội phân tử Tốt, chỉ cĩ 2 amino acid phải xem xét cho đầu cuối C *Lys-C là enzyme thuộc nhĩm serine protease cĩ khối lượng phân tử 33kDa **Glu-C hay cịn gọi là V8-protease thuộc nhĩm serine protease cĩ khối lượng phân tử 30kDa Yêu cầu quan trọng nhất là phải cắt đặc hiệu tại các vị trí cắt chuyên biệt. Ngồi ra cần chú ý đến kích thước trung bình của peptide tạo thành. Trypsin cho số lượng lớn các peptide nhỏ, trong khi Lys-C lại cho số lượng peptide ít nhưng phân tử cĩ kích thước khá lớn. Một trình tự amino acid được xác định dễ dàng nếu phân tích từ các peptide cĩ kích thước nhỏ hơn là peptide cĩ kích thước lớn. Vì thế gần như tất cả các yêu cầu cho phân tích phổ khối lượng và nghiên cứu dữ liệu thì trypsin là protease được sử dụng phổ biến nhất cho các ứng dụng trong thực tế. Các peptide tạo thành từ sự phân giải protein bởi trypsin cĩ khối lượng phân tử khoảng 500-2500Da đáp ứng được yêu cầu phân tích của phương pháp phổ khối lượng. Hơn nữa các amino acid base chắc chắn nằm ở đầu cuối của chuỗi peptide, vì vậy dễ dàng dự đốn bởi sắc phổ đồ MS-MS [93]. 31 Xác định protein dựa trên bản đồ khối lượng peptide Protein sau khi bị phân giải bởi enzyme cắt chuyên biệt thu hỗn hợp các peptide và được tách ra bằng phổ khối lượng MALDI-TOF-TOF hoặc ESI-MS-MS để xác định khối lượng phân tử chính xác các peptide này. Sau đĩ so sánh với tất cả các dữ liệu về trình tự amino acid của các peptide hoặc dịch mã thành trình tự nucleotide trên các website. ðể lập bản đồ peptide của một protein một cách chính xác và cĩ ý nghĩa thống kê thì khối lượng peptide xác định thực tế và tính tốn phải được xem xét qua hai thơng số sau: - ðoạn peptide cĩ khối lượng đã xác định trong thực nghiệm được so sánh tương đồng (match) với peptide cĩ khối lượng biết trước từ những protein cĩ trong dữ liệu, nếu càng gần lồi hoặc nhĩm với nhau thì độ tin cậy càng cao. - Số lượng các peptide sử dụng để so sánh với các dữ liệu trên một phần mềm nào đĩ càng lớn thì tính chuyên biệt càng cao. Khối lượng chính xác của các peptide phân tích là vấn đề quan trọng. Hiện nay, cơng cụ thực hiện thường là MALDI kết hợp với phổ kế thời gian bay phản xạ (R-TOF) là lý tưởng nhất để nghiên cứu các dữ liệu với sự chính xác trong dãy 30-50ppm. Các kỹ thuật nghiên cứu khối lượng peptide chính xác cũng được đưa vào trong tiến trình thí nghiệm như thiết lập đường cong nội chuẩn, bằng cách trộn vào mẫu phân tích trypsin đã biết trình tự amino acid, enzyme này cĩ khả năng tự thủy phân chính nĩ tạo ra các peptide cĩ khối lượng chính xác. Mặc khác sự cải biến các mạch nhánh của amino acid đặc biệt như cysteine, methionine, hoặc metyl hĩa các nhĩm carboxyl của đoạn peptide nhằm cĩ thể suy đốn trình tự các amino acid trong đoạn peptide. Dưới đây là một vài tiêu chuẩn khi xác định protein bằng bản đồ khối lượng peptide: + Protein mục tiêu phải đứng đầu bảng trong danh sách các peptide được so sánh tương đồng trên dữ liệu. + Ít nhất cĩ 5 peptide được phát hiện để cho sự so sánh tương đồng cĩ ý nghĩa. + ða số khối lượng các peptide được so sánh tương đồng trong phạm vi nồng độ 50ppm 32 1.4 ðặc điểm sinh học và dinh dưỡng của ấu trùng tơm sú 1.4.1 Phát triển của ấu trùng tơm sú Theo Holthius (1980) và Barnes (1987) trích dẫn bởi Trần Ngọc Hải và ctv (1999) [12] thì tơm sú thuộc: Ngành: Arthropoda Ngành phụ: Crustacea Lớp: Malacostraca Lớp phụ: Eumalacostraca Bộ: Decapod Họ: Penaeidae Giống: Penaeus Lồi: Penaeus monodon Tơm sú tăng trưởng rất nhanh bằng cách lột vỏ, khoảng 4 - 5 tháng thì đạt độ trưởng thành, trọng lượng khoảng 28 gam [42]. Tơm sú đẻ quanh năm nhưng tập trung vào hai thời kỳ chính: tháng 3 - 4 và tháng 7 - 8 [39]. Sau khi tơm đẻ từ 12 - 15 giờ, trứng nở ra ấu trùng [43]. Ấu trùng phát triển qua 3 giai đoạn: - Giai đoạn Nauplius (N): chia thành 6 giai đoạn phụ từ N1 đến N6 và kéo dài khoảng 2 - 3 ngày [16]. Ấu trùng Nauplius mới nở dài khoảng 0,3 mm. Ấu trùng cĩ tập tính trơi nổi, hướng quang và tự dưỡng bằng nỗn hồng nên khơng cần cho ăn [23]. - Giai đoạn Zoea (Z): chia làm 3 giai đoạn phụ từ Z1 đến Z3 và kéo dài khoảng 4- 5 ngày [29]. Trong giai đoạn này tơm tăng trưởng rất nhanh, cơ thể chia thành 2 phần rõ rệt: phần đầu và phần bụng, xuất hiện mắt, chủy và gai trên mỗi đoạn bụng. Cuối giai đoạn này Zoea dài khoảng 3,2 mm. Ấu trùng Zoea-1 vẫn cịn sử dụng nỗn hồn trong khi đã bắt đầu ăn ngồi [23], thức ăn chính là các lồi tảo khuê như Skeletonema costatum, Chaetoceros sp., Tetraselmis sp., Nitzschia sp., vào thời kỳ Zoea-3 chúng ăn cả phiêu động vật [41]. Trong sản xuất giống cĩ thể cho ăn bổ sung thức ăn cơng nghiệp như Lansy, Frippak, tảo khơ,… hoặc thức ăn chế biến cĩ kích thước < 30 µm. - Giai đoạn Mysis (M): chia làm 3 giai đoạn từ M1 đến M3 và kéo dài khoảng 3 - 4 ngày [16]. Mysis cĩ hình dạng giống tơm con rất nhỏ, bơi ngửa và giật về phía sau. Cuối giai đoạn này Mysis dài khoảng 4,5 mm [23]. Mysis vẫn ăn tảo khuê nhưng bắt đầu chuyển sang thức ăn động vật, gồm ấu thể một số lồi giáp xác và thân mềm, giun nhiều tơ, trùng bánh xe, ấu trùng Artemia,… hoặc cĩ thể bổ sung thức ăn cơng nghiệp (Lansy, Frippak) hay thức ăn chế biến cĩ kích thước 30 - 100 µm. 33 Hình 1.9: Vịng đời của tơm sú (Motoh, 1981) - Giai đoạn ấu trùng: mất khoảng 9 - 10 ngày, sau đĩ biến thái thành hậu ấu trùng (Postlarvae) dài khoảng 5,2 mm [41]. Postlarvae cĩ hình dạng giống hệt tơm trưởng thành. Postlarvae cĩ khả năng bơi, bị và kẹp được thức ăn, cĩ khuynh hướng chuyển xuống bám vào thành hoặc đáy bể nuơi. Ngồi các lồi tảo khuê, thức ăn chủ yếu cho giai đoạn này là ấu trùng Artemia, thịt đầu tơm, hàu nghiền nhỏ hay các động vật phù du, sinh vật đáy, mùn bã hữu cơ, bột trùn… Một số kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy sử dụng bột trùn cĩ thể tạo ra tơm Postlarvae cĩ chất lượng cao hơn so với các loại thức ăn thơng thường. Giai đoạn hậu ấu trùng kéo dài khoảng 20 - 25 ngày [16]. Sau đĩ tơm chuyển sang thời kỳ ấu niên (Juvenile), chúng bơi lội ra biển, tiếp tục tăng trưởng và phát triển thành tơm trưởng thành, sinh sản và tiếp diễn chu kỳ sống. ðối với tơm nuơi, thì giai đoạn sau Postlarvae gọi là tơm giống. 1.4.2 Ảnh hưởng của các yếu tố mơi trường đến quá trình sống của ấu trùng tơm sú Các yếu tố mơi trường nước cĩ ảnh hưởng rất lớn đến sự phân bố, sinh sống, bắt mồi, tăng trưởng và tỷ lệ sống của tơm. 34
Nhiệt độ Tơm sú thuộc loại động vật máu lạnh nên nhạy cảm với sự thay đổi về nhiệt độ, đặc biệt là tơm ở giai đoạn ấu trùng. Theo Vũ Thế Trụ (2000), nhiệt độ thích hợp cho ấu trùng tơm sú phát triển là 27 - 30°C [41] và theo Nguyễn Thanh Phương và ctv (1999) nhiệt độ 28 - 30°C là thích hợp nhất [22]. Nhiệt độ quá cao hay quá thấp hoặc thay đổi đột ngột quá 2°C đều gây bất lợi cho sự tăng trưởng của chúng.
ðộ mặn Ấu trùng tơm sú cĩ thể chịu được sự biến động về độ mặn rất lớn 3-45‰, nhưng độ mặn thích hợp cho tăng trưởng của chúng là khoảng 27-30‰ [41], 28-30‰ [22]. Nếu độ mặn mơi trường thay đổi đột ngột chênh lệch quá 3‰ dễ làm ấu trùng tơm nhiễm bệnh [41].
Oxy hịa tan Oxy hịa tan trong nước là một yếu tố quan trọng trong ương nuơi ấu trùng tơm, nĩ ảnh hưởng lớn đến tỷ lệ sống và tình trạng sức khỏe tơm. Sự thiếu dưỡng khí là nguyên nhân gây đột tử cao và nhanh nhất cho ấu trùng. ðể ấu trùng tơm tăng trưởng tốt, hàm lượng oxy hịa tan phải duy trì lớn hơn 5 ppm [41].
pH pH thích hợp nhất theo Bùi Quang Tề (2006) cho sự phát triển của ấu trùng tơm là 7,5 - 8,3 [28], theo Nguyễn Thanh Phương và ctv (1999) là 7,5 - 8,5 [22]. Khi pH lớn hơn 8,3 hầu hết ammonia chuyển thành dạng NH3 gây độc cho tơm, nhưng nếu pH nhỏ hơn 6,5 thì độ độc của H2S tăng lên (Boyd, 1992 trích trong Phạm Hồng Thống, 2004) [31].
Ammonia Ammonia hình thành do quá trình phân hủy bình thường của protein, xác bã thực vật phù du, thức ăn thừa, sản phẩm bài tiết của thủy sinh vật hay phân bĩn từ các nguồn vơ cơ, hữu cơ. Việc ương nuơi các đối tượng thủy sản trong hệ thống kín thường dẫn đến sự chuyển hĩa và tích tụ các chất thải trong mơi trường. Trong nước ammonia hiện diện dưới 2 dạng: dạng khí NH3 và dạng ion NH4 +. Trong đĩ dạng khí NH3 rất độc, ở nồng độ trên 1 ppm cĩ thể gây chết tơm [23]. Khi pH và nhiệt độ tăng thì tỷ lệ phần trăm tổng NH3 cũng tăng. Theo Boyd (1998) hoặc Chanratchakool 35 (2003) trích dẫn bởi Châu Tài Tảo (2005) hàm lượng ammonia thích hợp cho nuơi tơm là 0,2 - 2,0 ppm [26].
Nitrite Theo Phạm Văn Tình (1999), nồng độ nitrite dưới 1 ppm sẽ thích hợp cho sự phát triển của ấu trùng tơm sú [38]. Ở nồng độ cao 4-5 ppm cĩ thể ảnh hưởng bất lợi cho tơm [23]. 1.4.3 Nhu cầu dinh dưỡng của tơm sú Thức ăn là nguồn cung cấp dinh dưỡng cho quá trình trao đổi chất của tơm, do đĩ thức ăn cĩ vai trị quyết định đến năng suất, sản lượng và hiệu quả của nghề ương tơm. Việc lựa chọn thức ăn phù hợp với từng giai đoạn phát triển của tơm và đảm bảo một số chỉ tiêu về tốc độ tăng trưởng, tỷ lệ sống luơn là vấn đề tiên phong của nhà sản xuất giống. Nhìn chung, thức ăn cho tơm cần phải cĩ đầy đủ các amino acid và acid béo khơng thay thế, các vitamin, chất khống và những chất cần cho sự phát triển khác đồng thời phải đảm bảo đủ năng lượng để duy trì sự sống, hoạt động bơi lội, tăng trưởng và sinh sản. Cĩ thể phân chia các chất dinh dưỡng cần cho thức ăn tơm thành 5 nhĩm chính là protein, lipid, carbohydrate, các vitamin và chất khống.
Protein Protein được xem là yếu tố quan trọng hàng đầu trong dinh dưỡng của tơm. Chế độ ăn nếu thiếu protein sẽ làm tơm chậm lớn và dễ bị bệnh [30]. Protein khi vào cơ thể tơm sẽ được phân giải thành các amino acid rồi được hấp thu qua thành ruột non để chuyển tới các tổ chức cơ thể. Khi cung cấp protein cho tơm cần chú ý tới cả số lượng và chất lượng. Protein được đánh giá là cĩ giá trị cao khi trong thành phần cĩ đủ các amino acid thiết yếu ở tỷ lệ thích hợp. Các amino acid thiết yếu cho tơm bao gồm: tryptophan, lysine, methionine, leucine, isoleucine, phenylalanine, threonine, valine, histidine và arginine [23], [30]. Những amino acid này cơ thể tơm khơng tự tổng hợp được hoặc tổng hợp với tốc độ khơng đáp ứng nhu cầu cơ thể. Thiếu một trong các amino acid này sẽ dẫn tới rối loạn cân bằng đạm và rối loạn sử dụng các amino acid cịn lại [30]. Do đĩ trong chế độ ăn cần cung cấp đầy đủ amino acid thiết yếu, theo Nguyễn Thanh Phương và Trần Ngọc Hải 36 (2004) tỷ lệ các amino acid trong thức ăn càng gần với tỷ lệ các amino acid của cơ thể tơm sẽ cho kết quả tăng trưởng tốt hơn [23]. Nhìn chung nhu cầu đạm của tơm nhỏ cao hơn tơm trưởng thành. Theo Alava và Lim (1983) được trích bởi Nguyễn Thanh Phương và Trần Ngọc Hải (2004), tơm giống cĩ nhu cầu protein khoảng 40%, tơm thịt khoảng 35 - 40%, cịn theo Nguyễn Văn Thoa và Bạch Thị Quỳnh Mai (1996) thì hàm lượng protein trong thức ăn cho ấu trùng tơm phải là 65 - 70%, cho tơm ở giai đoạn từ PL-15 đến PL-45 là 40 - 45%. Tiêu chuẩn ngành 28 TCN 102: 2004 quy định thức ăn cho tơm phải cĩ hàm lượng protein thơ từ 35 - 42% trở lên. ðạm thực vật tuy rẻ nhưng kém giá trị hơn đạm động vật do thiếu một số amino acid thiết yếu, vì vậy cần phối trộn nhiều loại để hỗ trợ cho nhau. Nguồn protein chủ yếu trong tự nhiên là bột cá, bột mực, bột đầu tơm, Artemia, bột trùn quế, bột đậu nành…
Lipid Lipid là nguồn sinh năng lượng quan trọng cho tơm, năng lượng từ lipid gấp 2,25 lần so với protein hay carbohydrat [30]. Ngồi ra, lipid cịn cần thiết để hấp thu các vitamin A, D, E, K và là nguồn cung cấp nhiều chất cần thiết cho cơ thể tơm như các acid béo chưa no thiết yếu, cholesterol, lecithin... Thành phần chính của lipid là acid béo, do đĩ các acid béo sẽ quyết định tính chất của lipid. Lipid được đánh giá là cĩ hoạt tính sinh học cao khi trong thành phần cĩ nhiều acid béo cĩ từ 2 nối đơi trở lên: linoleic (2 nối đơi), linolenic (3 nối đơi), arachidonic (4 nối đơi)…Về tính chất sinh học cĩ thể xếp các acid béo chưa no vào các chất cần thiết cho cơ thể tơm như là những sinh tố. Theo Trần Thị Thanh Hiền và ctv., (2004) nhu cầu các acid béo thiết yếu đối với tơm giai đoạn ấu trùng cao hơn giai đoạn trưởng thành, vì vậy trong giai đoạn đầu cần bổ sung thêm mỡ cá hay dầu gan cá, dầu mực vào thức ăn tơm [15]. Cholesterol là một dạng sterol cĩ ảnh hưởng lớn nhất đến sinh trưởng và tỷ lệ sống của nhiều loại giáp xác (Teshima và Kanazama,1983 trích dẫn bởi Trần Thị Thanh Hiền và ctv, 2004) [15], nhưng chúng khơng cĩ khả năng tự tổng hợp (Kanazawa et al., 1971; Castell et al., 1975 trích dẫn bởi Trần Thị Thanh Hiền và ctv, 2004), vì vậy thức ăn cĩ hàm lượng cholesterol 1% sẽ giúp tơm lớn nhanh, chuyển hĩa thức ăn tốt, hiệu quả hấp thu đạm tăng và nâng cao tỷ lệ sống [23], [30]. Bên cạnh đĩ, lecithin cũng là một 37 lipid phức tạp khơng thể thiếu trong thức ăn tơm. Theo Nguyễn Thanh Phương và Trần Ngọc Hải (2004) thức ăn cĩ hàm lượng 4% lecithin từ đậu nành giúp tơm lớn nhanh [23]. Tơm càng nhỏ hoặc thức ăn càng nhiều chất béo thì càng cần nhiều lecithin [30]. Nguồn lipid chủ yếu trong tự nhiên: đậu phộng, dầu dừa, dầu cải, mỡ cá, dầu gan cá, dầu mực, mỡ động vật…
Carbohydrate Vai trị chính của carbohydrate là nguồn cung cấp năng lượng, ngồi ra cịn cĩ vai trị tạo hình. Nguồn carbohydrate chủ yếu là tinh bột. Tinh bột khi vào cơ thể tơm sẽ bị phân giải thành các tiểu đơn vị glucose rồi tạo thành glycogen. Glycogen là nguồn dự trữ cho các cơ và cơ quan. Cellulose cũng là một dạng carbohydrate thường gặp, mặc dù khĩ tiêu hĩa nhưng cellulose rất hữu ích cho việc điều hịa bài tiết và kích thích hệ vi khuẩn cĩ ích ở đường ruột. Nhu cầu về carbohydrate của tơm ở các giai đoạn phát triển khác nhau rất khác nhau. Tỷ lệ giữa protein, chất béo, carbohydrate trong thức ăn của tơm cũng khác nhau. Nguồn carbohydrate chủ yếu trong tự nhiên: cám gạo, bột bắp, bột mì, các loại củ, khoai…
Vitamin Vitamin cĩ vai trị rất lớn đối với cơ thể tơm, chúng cần thiết cho các quá trình chuyển hĩa trong cơ thể, trong đĩ cĩ quá trình đồng hĩa và sử dụng các chất dinh dưỡng cũng như quá trình lớn, xây dựng tế bào và tổ chức cơ thể. Phần lớn vitamin khơng được tổng hợp trong cơ thể mà chỉ được cung cấp từ các nguồn thức ăn. Nhu cầu về vitamin của tơm khơng lớn nhưng nếu thiếu sẽ gây nên nhiều rối loạn chuyển hĩa quan trọng. Các vitamin cần cho tơm bao gồm cả các vitamin tan trong chất béo: A, D, E, K và các vitamin tan trong nước: B1, B2, B6, B12, biotin, C.
Chất khống Chất khống chiếm 2 - 4% trọng lượng cơ thể tơm, trong đĩ cĩ đến 50% là yếu tố tạo hình. Cũng giống như vitamin, chất khống khơng được tổng hợp trong cơ thể mà chỉ cĩ được từ các nguồn thức ăn. Chất khống tham gia vào tất cả các quá trình sinh hĩa của cơ thể, hoạt tính sinh học thể hiện cao nhất dưới dạng các ion. 38 Chất khống quan trọng cho cơ thể tơm gồm cả các khống đa lượng: Ca, P, K, Na, Cl, S, Mg… và khống vi lượng: Fe, Co, Mn, Iod, F, Cu, Zn, Mo… Thực tế trong sản xuất tơm giống hiện nay, người ương thường sử dụng kết hợp giữa thức ăn tươi sống với thức ăn nhân tạo [12]. Sử dụng tốt thức ăn nhân tạo sẽ giúp hạn chế được bệnh lây nhiễm từ thức ăn tươi sống và chủ động được nguồn thức ăn trong ương nuơi. Thức ăn cho tơm do phải cho ăn trong nước nên ngồi việc đảm bảo dinh dưỡng cân đối, kích thước phù hợp và cĩ mùi hấp dẫn kích thích sự bắt mồi của tơm, cịn cĩ yêu cầu đặc biệt là phải ở dạng viên hoặc mảnh lâu tan trong nước. Hiện nay, nhà nước cũng đã ban hành văn bản quy định các chỉ tiêu thức ăn cho tơm (xem phụ lục 1) 1.4.4 Tình hình sử dụng nguồn thức ăn dinh dưỡng cho tơm Việc chuyển đổi cơ cấu kinh tế từ trồng lúa sang nuơi các loại tơm, cá xuất khẩu ở đồng bằng sơng Cửu long, nơi cĩ các điều kiện thiên nhiên thuận lợi và đã trở thành khu vực xuất khẩu thủy sản lớn nhất nước. Vì vậy, nguồn thức ăn để nuơi các loại tơm và cá giống hoặc tơm ở giai đoạn ấu trùng ngày càng cĩ nhu cầu lớn. Với hàm lượng đạm trên 50%, chất béo trên 10% và acid béo khơng no cĩ nhiều nối đơi (HUFA) biến động trong khoảng 0,3-15mg [76], [100], sinh khối Artemia ngày càng trở thành nguồn thức ăn được chọn lựa để thay thế cho nhiều loại thức ăn tươi sống khác. Các nghiên cứu trên Artemia làm thức ăn ương ấu trùng tơm sú và tơm càng xanh [31], [45] cũng đã minh chứng nguồn thức ăn dinh dưỡng đầy tiềm năng này. Tuy nhiên, trên thị trường, loại chế phẩm Artemia sản xuất tại Vĩnh Châu giá thành rất đắt khoảng 800.000-1.300.000đồng/1kg, cịn lại các lọai thức ăn chứa đạm cao cấp đều phải nhập từ các nước ðài loan, Thái lan, Mỹ với giá rất đắt từ 800.000-1.800.000 đồng/1kg. Nhu cầu về nguồn đạm của tơm giống là rất cao, hiện nay cũng đã cĩ một số nghiên cứu dị tìm thêm các nguồn thức ăn giàu đạm để cĩ thay thế các lồi đạm từ cá. Ở Úc, nghiên cứu sử dụng đạm từ thịt trùn thay thế thịt cá cho việc nuơi loại tơm hùm nhỏ, kết quả hồn tồn khơng làm giảm tỉ lệ tăng trưởng của tơm ở các nghiệm thức thay thế với các tỉ lệ thay thế 50, 75 và 100% [69]. Sogbesan và ctv (2008), đã nghiên cứu sử dụng 25% protein trùn đất thay thế nguồn đạm protein từ bột cá vào thức ăn nuơi cá hồi nhỏ Heterobranchus longifilis đạt kết quả tốt về tốc độ sinh trưởng mà vẫn bảo đảm chất lượng cho mơi trường nuơi [99]. Hiện nay, một số nơng dân ở các tỉnh Vĩnh long, An giang, Thành phố Cần thơ, 39 đã sử dụng thêm nguồn thức ăn trực tiếp từ trùn quế giàu đạm để bổ sung thêm khẩu phần dinh dưỡng cho các loại tơm cá vừa qua giai đoạn ấu trùng, hoặc khơi phục sức khỏe vật nuơi sau dịch bệnh đạt kết quả rất khả quan. Tuy nhiên, trùn quế hiện nay vẫn cịn được dùng chủ yếu dạng trùn tươi nên chưa chủ động được nguồn nguyên liệu, đồng thời cũng rất khĩ khăn trong việc vận chuyển xa và khơng bảo quản được lâu. Xuất phất từ các nhu cầu trên chúng tơi đã nghiên cứu ứng dụng việc sản xuất bột đạm cao cấp từ trùn quế để phối trộn vào thức ăn nuơi ấu trùng tơm và cá con là hướng đi mới và cần thiết để phục vụ cho nuơi trồng thủy sản.