Nghiên cứu quần thể anopheles minimus tại xã Bình Thạnh huyện Tuy Phong tỉnh Bình Thuận

20 CHÖÔNG 3 PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU 21 3.1. NOÄI DUNG NGHIEÂN CÖÙU 3.1.1. Khaûo saùt caùc yeáu toá moâi tröôøng treân caïn taïi Bình Thaïnh. 3.1.2. Khaûo saùt caùc yeáu toá moâi tröôøng nöôùc taïi Bình Thaïnh. 3.1.3. Kieåu hình cuûa Anopheles minimus. 3.1.4. Kieåu gen cuûa Anopheles minimus. 3.1.5. Muøa phaùt trieån cuûa Anopheles minimus. 3.1.6. Taäp tính cuûa Anopheles minimus. 3.1.7. Tæ leä nhieãm KSTSR cuûa Anopheles minimus. 3.1.8. Phaûn öùng cuûa Anopheles minimus vôùi hoaù chaát alpha cypermethrine vaø lambda-cyhalothrine. 3.2. ÑOÁI TÖÔÏNG NGHIEÂN CÖÙU Ñeà taøi nghieân cöùu treân ñoái töôïng laø muoãi Anopheles minimus Theobald, 1901. 3.2.1. Voøng ñôøi muoãi Anopheles. Beänh soát reùt ñöôïc truyeàn cho ngöôøi do muoãi caùi thuoäc gioáng Anopheles. Muoãi ñöïc chæ huùt nhöïa caây, maät hoa, khoâng ñoát maùu ngöôøi do ñoù khoâng theå truyeàn beänh. Theo G.B. White (1982) [50] treân theá giôùi coù khoaûng 400 loaøi Anopheles ñöôïc phaùt hieän trong ñoù coù khoaûng 67 loaøi coù khaû naêng truyeàn soát reùt. Theo Traàn Ñöùc Hinh (1997) [13] ôû Vieät Nam coù 59 loaøi Anopheles, trong ñoù coù 7 loaøi coù phaûn öùng döông tính vôùi khaùng theå ñôn doøng cuûa KSTSR. Caùc veùc tô truyeàn soát reùt chính ôû Vieät Nam laø Anopheles minimus, Anopheles dirus, Anopheles sundaicus. Voøng ñôøi cuûa Anopheles coù 4 giai ñoaïn khaùc nhau: tröùng, boï gaäy, quaêng vaø muoãi, trong ñoù chæ coù giai ñoaïn muoãi soáng treân caïn. Muoãi caùi caàn ñoát maùu ñeå 22 phaùt trieån tröùng, tröùng thöôøng ñöôïc ñeû tröôùc khi muoãi ñoát maùu laàn sau, hình thaønh caùc chu kyø sinh thöïc trong ñôøi soáng cuûa muoãi. Thôøi gian cuûa moät chu kyø sinh thöïc phuï thuoäc vaøo nhieät ñoä moâi tröôøng. Muoãi caùi ñeû tröùng trong suoát ñôøi soáng cuûa noù. Trung bình chuùng coù theå ñeû ñöôïc 1-3 löùa. Trong ñieàu kieän thuaän lôïi muoãi caùi Anopheles coù theå soáng töø 2-3 tuaàn. Tröùng muoãi ñöôïc ñeû xuoáng nöôùc, moãi löùa töø 100-150 tröùng. Moãi moät loaøi Anopheles choïn moät thuyû vöïc thích hôïp ñeå ñeû tröùng. Sau 2-3 ngaøy tröùng nôû thaønh boï gaäy. Boï gaäy Anopheles thöôøng naèm song song vôùi maët nöôùc ñeå laáy khoâng khí. Thôøi kyø boï gaäy chia laøm 4 giai ñoaïn (tuoåi). Boï gaäy loät xaùc töø tuoåi 1 sang tuoåi 2, 3, 4. Moãi giai ñoaïn keùo daøi khoaûng 2-3 ngaøy tuyø thuoäc vaøo ñieàu kieän moâi tröôøng coù thuaän lôïi cho söï phaùt trieån cuûa chuùng hay khoâng. Nhieät ñoä, aùnh saùng, löôïng thöùc aên coù aûnh höôûng lôùn ñeán thôøi gian phaùt trieån cuûa boï gaäy. Trong ñieàu kieän bình thöôøng giai ñoaïn boï gaäy keùo daøi töø 8 -10 ngaøy. Boï gaäy tuoåi 4 loät xaùc thaønh quaêng. Quaêng khoâng aên, chæ tieâu chaát döï tröû. Giai ñoaïn quaêng keùo daøi 2-3 ngaøy, sau ñoù quaêng phaùt trieån thaønh muoãi. Muoãi Anopheles giao phoái vôùi nhau khi ñang bay. Söï thuï tinh chæ xaûy ra moät laàn sau ñoù tinh truøng ñöôïc döï tröû trong tuùi tinh trong cô theå muoãi caùi vaø thuï tinh cho tröùng daàn daàn. Haàu heát Anopheles ñoát moài vaøo ban ñeâm, vaøo nöûa ñaàu hay nöûa cuoái cuûa ñeâm. Coù loaøi thích vaøo nhaø ñoát moài (endophagic), coù loaøi thích ñoát moài ngoaøi nhaø (exophagic). Coù loaøi thích ñoát ngöôøi (anthropophilic), coù loaøi thích ñoát maùu suùc vaät (zoophilic). Thôøi gian truyeàn KSTSR vaøo vaät chuû coù theå thay ñoåi tuyø vaøo nhieät ñoä, chuûng loaïi KSTSR... 3.2.2. Chu kyø cuûa KSTSR trong cô theå muoãi 23 Muoãi caùi Anopheles huùt maùu beänh nhaân coù KSTSR ôû theå giao baøo (gametocyste). Giao baøo phaùt trieån thaønh gametes ñöïc vaø caùi vaøo trong daï daøy muoãi, sau 10 - 20 phuùt keát hôïp thaønh hôïp töû (zygote), vaøi giôø sau hôïp töû phaùt trieån keùo daøi ra thaønh hình thoi di ñoäng goïi laø ookinete. Ookinete len qua nhöõng teá baøo thaønh daï daøy, baùm chaët vaøo thaønh ngoaøi daï daøy, bieán thaønh nang baøo (oocyste). Nang baøo coù hình troøn vaø khoâng di ñoäng. Nang baøo phaùt trieån qua 4 giai ñoaïn, khi soi töôi döôùi kính hieån vi thì coù maøu trong suoát, khi nhuoäm thì baét maøu xanh saãm. Thöôøng nang baøo xuaát hieän ôû thaønh ngoaøi daï daøy muoãi 2 ngaøy sau khi muoãi ñoát maùu beänh nhaân. Nang baøo lôùn daàn, phaân chia thaønh haøng ngaøn phaân töû nhoû coù hình thoi, daøi khoaûng 15μm, coù moät nhaân ôû giöõa goïi laø thoa truøng (sporozoite). Nang baøo phaùt trieån ñeán tuoåi 4 phaù vôõ thaønh daï daøy tung thoa truøng ra ngoaøi, thoa truøng theo haïch baïch huyeát ñeán taäp trung ôû tuyeán nöôùc boït cuûa muoãi vaø truyeàn sang cho ngöôøi khi muoãi ñoát ngöôøi. 3.2.3. Muoãi Anopheles minimus Muoãi Anopheles minimus trong heä thoáng phaân loaïi Ngaønh chaân khôùp : Arthropoda Lôùp coân truøng : Insecta Boä hai caùnh : Diptera Boä phuï raâu daøi: Nematocera Hoï muoãi : Culicidae Phaân hoï muoãi soát reùt: Anophelinae Gioáng : Anopheles Phaân gioáng: Cellia Muoãi Anopheles minimus 24 Anopheles minimus raát ña daïng veà hình thaùi. Muoãi Anopheles minimus kieåu hình A coù thaân nhoû, maøu ñen, xuùc bieän coù 3 baêng traéng, caùnh coù moät ñieåm traéng giaùn ñoaïn ôû gaân goác caùnh, voøi muoãi nhoû thanh, maøu ñen nhaït, ñaàu muùt voøi coù maøu vaøng naâu, gaân caùnh L6 coù 2 ñieåm ñen, L5 coù 3 ñieåm ñen, dieàm caùnh giaùn ñoaïn ôû taát caû caùc gaân tröø gaân L6. (Phuï luïc) Caùc taùc giaû Hoà Ñình Trung, Nguyeãn Ñöùc Maïnh, Traàn Ñöùc Hinh, Marc Coosemans (1996) [37], phaân bieät caùc daïng cuûa muoãi Anopheles minimus nhö sau: Anopheles minimus kieåu hình A: coù giaùn ñoaïn goác caùnh taïi taïi ñieåm presector treân gaân costa, khoâng coù ñieåm traéng humeral. Anopheles minimus kieåu hình B: khoâng coù giaùn ñoaïn goác caùnh ôû caû 2 ñieåm presector vaø humeral treân gaân costa. Anopheles minimus kieåu hình C: coù giaùn ñoaïn goác caùnh ôû caû 2 ñieåm presector vaø humeral treân gaân costa.(Phuï luïc) Boï gaäy Anopheles minimus Phaàn ñaàu: coù loâng moâi trong xa nhau, loâng aêng ten ñôn, loâng moâi ngoaøi vaø loâng moâi trong khoâng phaân nhaùnh. Phaàn buïng: töø ñoát IV - ñoát VII coù khaùnh löng lôùn ( roäng hôn khoaûng caùch giöõa goác caùc ñoâi loâng laù coï). Bôø döôùi khaùnh löng ñoát buïng II nhaün; loâng soá 0 töø ñoát buïng ñoát IV - ñoát VII thöôøng chia nhaùnh vaø naèm ngoaøi khaùnh. (Phuï luïc) 3.3. THÔØI GIAN NGHIEÂN CÖÙU Nghieân cöùu ñöôïc tieán haønh töø thaùng 3/2006 ñeán thaùng 3/2007. 3.4. ÑÒA ÑIEÅM NGHIEÂN CÖÙU 25 Nghieân cöùu ñöôïc thöïc hieän taïi xaõ Bình Thaïnh, huyeän Tuy Phong, tænh Bình Thuaän. Bình Thuaän laø moät tænh duyeân haûi Nam Trung Boä coù ñòa hình phöùc taïp do ôû taän cuøng cuûa Nam Tröôøng Sôn, nôi coù caùc daõy nuùi chaïy ra saùt bieån, chia caét daõy ñoàng baèng nhoû heïp ra thaønh nhieàu ñoaïn nhoû, caùc daõy nuùi naøy ñeàu chaïy theo höôùng taây baéc - ñoâng nam vaø thaáp daàn theo höôùng ñoù taïo cho ñòa hình doác veà phía bieån. Bình Thuaän naèm trong khu vöïc khí haäu aù xích ñaïo gioù muøa hôi khoâ, coù nhieät ñoä cao vaø löôïng möa ít nhaát trong caû nöôùc [10]. Soá lieäu ño ñaïc ñöôïc trong nhieàu naêm taïi caùc traïm Khí töôïng Thuyû vaên cho thaáy nhieät ñoä trung bình taïi tænh Bình Thuaän laø 26,60C. Thaùng 5 laø thaùng coù nhieät ñoä cao nhaát (28,3˜0C). Thaùng 1 laø thaùng coù nhieät ñoä thaáp nhaát (24,70C). Thaùng10 laø thaùng coù aåm ñoä cao nhaát (86,2%). Thaùng 3 laø thaùng coù aåm ñoä thaáp nhaát (69,5%). Löôïng möa trung bình laø 1152mm [6]. Xaõ Bình Thaïnh thuoäc huyeän Tuy Phong, tænh Bình Thuaän coù toaï ñoä xaùc ñònh 11011’82” vó ñoä Baéc, 1080 41’39” kinh ñoä Ñoâng. Ranh giôùi : Phía baéc giaùp thò traán Lieân Höông, phía taây giaùp xaõ Chí Coâng, phía ñoâng vaø nam giaùp Bieån Ñoâng . Ñoä cao 6,55 m so vôùi möïc nöôùc bieån Theo taùc giaû Vuõ Töï Laäp (2003) [19] Bình Thaïnh naèm trong heä ñòa sinh thaùi coàn caùt ven bieån noäi chí tuyeán gioù muøa khoâ haïn, hình thaønh treân ñaát caùt ngheøo naøn, ñoàng thôøi taùc ñoäng cuûa gioù bieån raát maïnh, cho neân sinh khoái vaø naêng suaát raát thaáp. Thöïc vaät chuû yeáu laø coû, xen ít caây buïi, khoâng phuû kín ñöôïc maët caùt. Thaûm thöïc vaät goàm coù Coû loâng choâng, Coû gaø, Coû gaáu, Coû göøng, Muoáng bieån , Xöông roàng, Döùa daïi, Döùa sôïi, caây goã chuû yeáu coù Phi lao. 26 Bình Thaïnh coù hai muøa: muøa khoâ töø thaùng 1 ñeán thaùng 6, muøa möa töø thaùng 7 ñeán thaùng 12. Bình Thaïnh coù 2 höôùng gioù: gioù ñoâng baéc thoåi vaøo caùc thaùng 1, 2; gioù taây nam thoåi vaøo caùc thaùng 7, 8. Soá lieäu ñieàu tra thaùng 3 naêm 2006 cho thaáy: Bình Thaïnh coù dieän tích 26,682 km2. Daân soá cuûa xaõ laø 2777 ngöôøi, thuoäc 551 hoä, trong ñoù 97% ngöôøi Kinh, 3% ngöôøi Chaêm. Veà cô caáu ngheà nghieäp coù 37% soá hoä laøm ngheà noâng laâm thuyû saûn, 54 % laøm dòch vuï, 9% laø coâng nhaân vaø caùc ngheà khaùc . Caùc ñieàu tra cuûa Vieän Soát reùt Kyù sinh truøng Coân truøng Quy Nhôn töø 1977 ñeán 2000 cho thaáy taïi Bình Thaïnh thöôøng xuyeân coù maët muoãi Anopheles minimus vôùi maät ñoä cao: 13 con/giôø/ngöôøi (Phöông phaùp moài ngöôøi, thaùng 8 naêm 1983). Töø 1980 - 1994 tæ leä nhieãm kyù sinh truøng soát reùt cuûa ngöôøi daân ñòa phöông luoân cao hôn 5% . Thaùng 5 naêm 1994 moät ñieåm kính hieån vi ñöôïc ñaët ngay taïi Traïm xaù xaõ ñeå phaùt hieän ñieàu trò kòp thôøi beänh nhaân soát reùt. Töø 1994 - 2005, nhôø hoaït ñoäng hieäu quaû cuûa ñieåm kính, tæ leä nhieãm KSTSR giaûm haún, thöôøng khoâng cao hôn 2% (Soá lieäu Traïm Y teá xaõ Bình Thaïnh). 27 Bac Binh Tanh Linh Ham Tan Ham Thuan B ac Tuy Phong Ham Thuan N am Duc Linh Tp. Phan Thiet Baûn ñoà tænh Bình Thuaän Phan Dung Phong Phu Phu Lac Vinh Tan Vinh Hao Chi Cong Binh Thanh Hoa Minh Hoa Phu Phuoc The Lien Huong town Phan Ri Cua town Baûn ñoà huyeän Tuy Phong 28 3.5. PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU 3.5.1. Phöông phaùp khaûo saùt caùc yeáu toá moâi tröôøng - Phöông phaùp ño ñaïc Caùc yeáu toá moâi tröôøng treân caïn Vieäc xaùc ñònh caùc yeáu toá moâi tröôøng treân caïn ñöôïc thöïc hieän trong caùc vöôøn caây nôi coù muoãi Anopheles minimus sinh tröôûng. Moãi thoân choïn moät nhaø coù vöôøn ñeå ño ñaïc caùc yeáu toá moâi tröôøng vaø ñieàu tra muoãi Anopheles. Nhieät ñoä, aåm ñoä ñöôïc ño treân maùy töï ghi vaøo luùc 6 giôø, 12 giôø, 18 giôø, 24 giôø, laáy giaù trò trung bình. Toác ñoä gioù ñöôïc ño 4 laàn trong 1 ngaøy vaøo luùc 6 giôø, 12 giôø, 18 giôø, 24 giôø, thôøi gian ño 5 phuùt, laáy giaù trò trung bình. Cöôøng ñoä aùnh saùng ño 3 laàn trong 1 ngaøy vaøo luùc 6 giôø, 12 giôø, 18 giôø, thôøi gian ño 5 phuùt, laáy giaù trò trung bình. - Ño nhieät ñoä, aåm ñoä baèng maùy ño TESTO 635. - Ño toác ñoä gioù baèng maùy ño SIBATA Model ISA-80. - Ño cöôøng ñoä aùnh saùng baèng maùy ño SIBATA Model ANA-F11. Caùc yeáu toá moâi tröôøng nöôùc Ñoä pH, ñoä maën ñöôïc ño taïi 3 thuyû vöïc caùch nhau 1km, ño ôû vò trí caùch maët nöôùc 0,2 m, laáy giaù trò trung bình. - Ño pH baèng maùy ño pH JENWAY Model 3150. - Ño ñoä maën baèng maùy ño WQC-22A. - Ño möïc nöôùc 3 thuyû vöïc caùch nhau 1 km, laáy giaù trò trung bình. - Söû duïng soá lieäu löôïng möa trong naêm 2006 cuûa Ñaøi Khí töôïng Thuyû vaên traïm Soâng Luyõ (huyeän Baéc Bình) caùch Bình Thaïnh 35 km. 29 3.5.2. Phöông phaùp ñieàu tra Anopheles. Phöông phaùp choïn ñieåm ñieàu tra Taïi hai ñieåm nhoû nghieân cöùu laø thoân 1 vaø thoân 2 thuoäc xaõ Bình Thaïnh, moãi thoân choïn moät nhaø coù ngöôøi ôû ñeå ñieàu tra maät ñoä muoãi tìm moài trong nhaø vaø ngoaøi nhaø. Ñieàu tra muoãi ôû chuoàng gia suùc ñöôïc thöïc hieän ôû hai chuoàng boø cuûa hai nhaø khaùc ôû hai thoân. Ñieàu tra boï gaäy ôû caùc thuyû vöïc cuûa hai vöôøn trong hai thoân. Caùc ñieåm ñieàu tra ñöôïc choïn ngaãu nhieân vaø giöõ coá ñònh trong suoát thôøi gian nghieân cöùu. 5 phöông phaùp ñieàu tra Anopheles - Moài ngöôøi trong nhaø : Hai ngöôøi ñieàu tra trong hai ñeâm töø 19 giôø ñeán 5 giôø saùng ngaøy hoâm sau taïi 2 nhaø coá ñònh. - Moài ngöôøi ngoaøi nhaø : Hai ngöôøi ñieàu tra trong hai ñeâm töø 19 giôø ñeán 5 giôø saùng ngaøy hoâm sau taïi 2 nhaø coá ñònh. - Soi trong nhaø ngaøy : Hai ngöôøi ñieàu tra trong hai ngaøy töø 6 giôø ñeán 8 giôø taïi 10 nhaø coá ñònh . - Soi chuoàng gia suùc : Hai ngöôøi ñieàu tra trong hai ñeâm töø 20 giôø ñeán 24 giôø taïi 2 chuoàng coá ñònh . - Thu thaäp boï gaäy : Moãi loaïi thuyû vöïc ñieàu tra 100 baùt. Maät ñoä muoãi ñöôïc tính baèng soá löôïng muoãi moät ngöôøi thu thaäp ñöôïc trong moät giôø (con/giôø/ngöôøi) . Maät ñoä boï gaäy ñöôïc tính baèng soá löôïng boï gaäy moät ngöôøi thu thaäp ñöôïc trong 100 baùt (con/100 baùt ). 3.5.3. Caùc kyõ thuaät söû duïng trong nghieân cöùu 3.5.3.1. Kyõ thuaät ñònh loaïi Anopheles 30 Söû duïng caùc baûng ñònh loaïi Anopheles cuûa Vieän Soát reùt Kyù sinh truøng Coân truøng Trung öông (1987), Reid (1968), Harison (1980). Nguyeân taéc chung ñöôïc söû duïng ñeå thieát laäp khoaù ñònh loaïi Khoaù ñònh loaïi ñöôïc thieát laäp theo nguyeân taéc phaân nhaùnh löôõng phaân, söû duïng caùc ñaëc ñieåm ñoái laäp nhau ñeå loaïi tröø, moät loaøi khi coù moät ñaëc ñieåm naøy thì khoâng coù ñaëc ñieåm töông öùng khaùc. Ví duï : Loâng moâi coù phaân nhaùnh, loâng moâi khoâng phaân nhaùnh . Loâng bôø ngöïc ñôn, loâng bôø ngöïc keùp. Caùch söû duïng khoaù ñònh loaïi - Nhaän bieát caùc ñaëc ñieåm duøng ñeå ñònh loaïi töø toång quaùt ñeán chi tieát. - Quan saùt maãu vaät ñeå tìm caùc ñaëc ñieåm phaân loaïi. - Tra cöùu caùc ñaëc ñieåm cuûa maãu vaät trong khoaù phaân loaïi cho ñeán loaøi . - Khi coù moät ñaëc ñieåm truøng hôïp caàn xem xeùt caùc ñaëc ñieåm boå sung ôû caùc pha khaùc. Kyõ thuaät ñònh loaïi muoãi Anopheles - Gaây meâ muoãi baèng ether hay chloroform. - Cho muoãi ra ñóa petri, duøng kim moå caém vaøo ngöïc muoãi, giöõa ñoâi chaân thöù hai, cheách veà phía sau cho 2 caùnh muoãi xoeø ra. - Quan saùt muoãi baèng luùp tay coù ñoä phoùng ñaïi 10x, 20x, hoaëc luùp hai maét coù ñoä phoùng ñaïi 10x, 20x,40x sô boä nhaän xeùt caùc ñaëc ñieåm sau : muoãi ñöïc hay muoãi caùi, Anophelinae hay Culicinae, caùnh coù ñieåm traéng ñen hay ñoàng maøu, chaân coù hoa hay ñen tuyeàn, caùc ñoát baøn chaân coù baêng traéng hay khoâng coù baêng traéng. Sau khi coù khaùi nieäm chung, duøng luùp tay quan saùt chi tieát, so saùnh caùc ñaëc ñieåm ñoù vôùi baûng ñònh loaïi vaø xaùc ñònh loaøi. Ñaëc ñieåm cuûa muoãi Anopheles 31 Ôû phaàn ñaàu quan saùt caùc ñaëc ñieåm cuûa voøi vaø xuùc bieän - Voøi : Quan saùt maøu saéc cuûa voøi, voøi maøu ñen hay aùnh vaøng. - Xuùc bieän (palp): xaùc ñònh soá löôïng, kích thöôùc, söï phaân boá cuûa caùc baêng traéng treân xuùc bieän. Ôû phaàn ngöïc quan saùt caùc ñaëc ñieåm cuûa caùnh vaø dieàm caùnh - Caùnh: Quan saùt caùc gaân costa, subcosta; xaùc ñònh soá löôïng, kích thöôùc, söï phaân boá caùc ñieåm traéng ñen treân gaân caùnh töø L1 - L6. - Dieàm caùnh: xaùc ñònh söï phaân boá cuûa caùc ñieåm traéng ñen treân dieàm caùnh. Ôû phaàn buïng quan saùt vaø ñeám caùc chuøm loâng treân caùc ñoát buïng cuûa muoãi. Phaàn chaân - Quan saùt caùc vaûy traéng, ñieåm traéng, baêng traéng, chuøm loâng treân chaân. Xaùc ñònh soá löôïng, kích thöôùc, söï phaân boá cuûa chuùng treân caùc ñoát cuûa chaân. 3.5.3.2. Kyõ thuaät ñònh loaïi boï gaäy Anopheles Duøng oáng huùt ñaët boï gaäy leân lam kính, boï gaäy Anopheles ñaët naèm saáp, ñaàu boï gaäy höôùng veà phía ngöôøi soi kính. Ñaët lamen leân treân boï gaäy, traùnh di chuyeån lamen nhieàu laàn laøm ruïng loâng vaø maát caùc ñaëc ñieåm ñònh loaïi. Ñaàu tieân quan saùt toång quaùt boï gaäy ôû vaät kính 8x, sau ñoù chuyeån sang vaät kính 40x ñeå quan saùt caùc ñaëc ñieåm chi tieát, döïa vaøo baûng ñònh loaïi ñeå xaùc ñònh loaøi. Chæ ñònh loaïi boï gaäy tuoåi 3, 4; boï gaäy tuoåi 1, 2 chöa coù ñuû ñaëc ñieåm ñeå ñònh loaïi. Ñaëc ñieåm cuûa boï gaäy Anopheles Ôû phaàn ñaàu quan saùt caùc loâng aêng ten : ñôn hay keùp, vò trí cuûa loâng aêng ten. Caùc loâng moâi : caùc loâng moâi trong, ngoaøi, tröôùc, sau coù phaân nhaùnh hay 32 khoâng phaân nhaùnh, vò trí cuûa caùc loâng moâi. Loâng ñöôøng noái trong, ngoaøi, coù phaân nhaùnh hay khoâng phaân nhaùnh , soá löôïng nhaùnh loâng. Ôû phaàn ngöïc quan saùt caùc loâng bôø ngöïc: loâng bôø ngöïc ñôn hay keùp (chæ caàn 1 trong 3 loâng bôø ngöïc laø keùp thì keát luaän ñoù laø loâng bôø ngöïc keùp). Caùc loâng vai loâng vai trong, giöõa, ngoaøi, chung goác hay khoâng chung goác, phaân nhaùnh hay khoâng phaân nhaùnh. Loâng soá 4 ngöïc giöõa coù phaân nhaùnh hay khoâng, ruõ hay thaúng, soá löôïng nhaùnh. Loâng laù coï ñoát ngöïc sau : loâng laù coï coù phaùt trieån hay khoâng phaùt trieån. Ôû phaàn buïng quan saùt caùc loâng laù coï : caùc loâng laù coï phaùt trieån hay khoâng phaùt trieån, saéc toá cuûa caùc loâng laù coï. Xaùc ñònh hình daïng, kích thöôùc cuûa khaùnh. Quan saùt caùc loâng soá 0, 5, 7, 9… Khi ñònh loaïi phaûi theo thöù töï cuûa baûng ñònh loaïi, loaïi daàn nhöõng ñaëc ñieåm sai khaùc, khoâng ñi taét hay ñi ngöôïc töø döôùi leân. 3.5.3.3. Kyõ thuaät ñieàu tra muoãi - Phöông phaùp moài ngöôøi Muïc ñích cuûa phöông phaùp naøy laø xaùc ñònh thaønh phaàn, maät ñoä caùc loaøi Anopheles ñoát ngöôøi, thôøi gian muoãi ñoát moài trong ñeâm vaø muøa phaùt trieån cuûa muoãi trong naêm. Ngöôøi moài muoãi thöôøng maëc quaàn coäc hoaëc veùn quaàn leân ñeå chaân ra thu huùt muoãi. Vò trí moài coù theå ôû trong nhaø, ngoaøi saân hay ngoaøi röøng. Ngöôøi moài muoãi ngoài yeân, chôø cho muoãi ñeán ñoát maùu thì soi ñeøn pin baét. Duøng tube baèng thuyû tinh coù thuûng hai ñaàu ñeå baét muoãi. Duøng boâng khoâng thaám nöôùc ñeå ñaäy mieäng tube. Khoaûng 2 - 3 phuùt phaûi baät ñeøn leân ñeå kieåm tra, khoâng chieáu ñeøn tröïc tieáp vaøo muoãi vì aùnh saùng kích thích laøm muoãi bay maát. Ghi laïi giôø baét 33 muoãi, nôi baét muoãi. Moài ngöôøi thöôøng ñöôïc tieán haønh töø 18 giôø ñeâm ñeán 6 giôø saùng hoâm sau ñeå xaùc ñònh thôøi gian muoãi Anopheles hoaït ñoäng maïnh nhaát trong ñeâm vaø thaønh phaàn, maät ñoä caùc loaøi Anopheles ñoát moät ngöôøi trong moät ñeâm ( chæ soá Macdonalt). - Phöông phaùp soi muoãi trong nhaø ban ngaøy Muïc ñích cuûa phöông phaùp ñieàu tra naøy laø xaùc ñònh thaønh phaàn, maät ñoä caùc loaøi Anopheles coù taäp tính truù tieâu maùu trong nhaø. Xaùc ñònh vò trí, ñoä cao, giaù theå nôi muoãi truù tieâu maùu. Ñaùnh giaù taùc duïng cuûa hoaù chaát phun taåm trong nhaø Thôøi gian ñieàu tra : Tieán haønh vaøo buoåi saùng töø 6 -10 giôø ôû trong nhaø. Tay phaûi ngöôøi ñieàu tra caàm oáng nghieäm, tay traùi caàm ñeøn pin. Baét ñaàu tìm muoãi töø cöûa ra vaøo vaø ñi daàn vaøo trong, vöøa ñi vöøa roïi ñeøn vaøo töôøng, ñeøn caùch töôøng töø 30 - 40 cm, chieáu qua laïi, leân xuoáng. Chuù yù tìm nhöõng nôi coù ít aùnh saùng, kín gioù, ñoä cao töø 2 meùt trôû xuoáng, muoãi thöôøng ñaäu treân quaàn aùo, chaên maøn, trong caùc ñoà duøng gia ñình nhö xoong noài, chum vaïi …Khi thaáy muoãi uùp nhanh oáng nghieäm leân muoãi, di ñoäng qua laïi cho muoãi bay vaøo oáng, duøng boâng nuùt oáng laïi. Ghi vaøo nhaõn : ñòa ñieåm thu thaäp muoãi, huyeän, xaõ, soá nhaø, nôi ñaäu, ñoä cao so vôùi saøn nhaø cuûa töøng con, soá sella cuûa muoãi . - Phöông phaùp thu thaäp muoãi chuoàng gia suùc Muïc ñích cuûa phöông phaùp naøy laø xaùc ñònh thaønh phaàn, maät ñoä caùc loaøi Anopheles ñoát maùu suùc vaät. Thu thaäp muoãi cho caùc thöû nghieäm nhaïy khaùng vaø toàn löu hoaù chaát (bioassay). Tìm baét muoãi ñang ñoát maùu traâu boø, ñang ñaäu treân töôøng hay treân caùc ñaùm coû, buïi caây gaàn chuoàng. Duøng tube baèng thuyû tinh coù thuûng hai ñaàu ñeå baét muoãi. Duøng boâng khoâng thaám nöôùc ñeå ñaäy mieäng tube. Ghi laïi giôø baét muoãi, nôi baét muoãi. Thöôøng thu thaäp muoãi ôû chuoàng gia suùc töø 20 - 24 giôø. 34 3.5.3.4. Kyõ thuaät ñieàu tra boï gaäy Muïc ñích cuûa Kyõ thuaät naøy laø xaùc ñònh thaønh phaàn, maät ñoä caùc loaøi Anopheles ôû caùc thuyû vöïc ñaëc tröng cho töøng loaøi. - Thu thaäp boï gaäy ôû caùc thuyû vöïc nhoû: Tìm nhöõng vuõng nöôùc ôû hai beân bôø suoái, loøng suoái caïn, vuõng nöôùc ôû trong röøng … duøng baùt hôùt nheï nöôùc treân beà maët, ñoå vaøo khay men traéng, duøng oáng huùt baét boï gaäy cho vaøo loï. - Thu thaäp boï gaäy ôû caùc thuyû vöïc lôùn : Ñi men theo hai beân bôø soâng suoái vôùt boï gaäy baèng vôït. Ñaët khung vôït thaúng goùc vôùi maët nöôùc, moät nöûa vôït naèm treân maët nöôùc, moät nöûa vôït naèm döôùi maët nöôùc, chuyeån vôït töø töø song song vôùi bôø nöôùc moät ñoaïn daøi 2m roài keùo vôït leân, laät ngöôïc vôït vaøo khay men coù nöôùc, boï gaäy seõ rôi vaøo khay, duøng oáng huùt baét boï gaäy cho vaøo loï. ÔÛ moãi ñieåm duøng vôït baét moät ñoaïn daøi khoaûng 20 m. 3.5.3.5 Kyõ thuaät ñieän di protein enzyme - Nguyeân taéc cuûa kyõ thuaät Protein laø chaát ñieän li, khi ôû daïng dung dòch protein ôû traïng thaùi phaân cöïc ñieän tích. Trong moâi tröôøng cuûa dung dòch ñeäm coù pH khaùc nhau, protein seõ mang ñieän tích aâm hay döông. Trong ñieän tröôøng cuûa doøng ñieän moät chieàu, caùc phaân töû protein seõ chuyeån ñoäng veà phía anod hay catod theo toác ñoä khaùc nhau. Neáu phaân töû protein coù kích thöôùc nhoû, troïng löôïng phaân töû beù, löïc tónh ñieän lôùn thì seõ chuyeån ñoäng nhanh vaø ngöôïc laïi. Do ñoù, caùc phaân töû protein seõ naèm ôû vò trí khaùc nhau treân baûn gel sau khi chaïy ñieän di. 35 Söï toång hôïp caùc protein laø do caùc gen qui ñònh. Trong quaù trình tieán hoaù caùc gen coù theå thay ñoåi traïng thaùi vaø hình thaønh caùc allele khaùc nhau. Caùc allele khaùc nhau toång hôïp caùc protein coù caáu truùc baäc 1 khaùc nhau. Vì caùc protein khaùc nhau veà troïng löôïng, kích thöôùc phaân töû neân coù toác ñoä dòch chuyeån khaùc nhau trong quaù trình ñieän di. Chính söï taùch bieät cuûa caùc caáu töû sau quaù trình ñieän di ñaõ xaùc ñònh söï khaùc nhau veà di truyeàn cuûa caùc protein enzyme vaø cuõng laø söï khaùc nhau cuûa caùc allele cuûa moät gen. - Phöông phaùp cuûa C.A. Green,1990 Hai heä enzyme thöôøng ñöôïc söû duïng ñeå nghieân cöùu söï ña hình cuûa muoãi: - Octanol dehydrogenase Odh (E.C: 1.1.1.73) - Esterase Est (E.C:3.1.1.1) Vieäc phaân tích 2 heä enzyme ñöôïc thöïc hieän treân gel polyacrylamid 7,5% vôùi heä ñeäm T.E.B, pH = 8,5. Caùc böôùc tieán haønh : - Thu maãu: Maãu thu ñeå laøm ñieän di isozyme laø muoãi tröôûng thaønh, quaêng, boï gaäy coøn soáng ñöôïc giöõ ôû nhieät ñoä - 850C, hay ñöôïc ngaâm trong bình nitô loûng. - Nghieàn maãu: Maãu ñöôïc nghieàn trong 50μl dung dòch sucrose vaø triton X-100. - Naïp maãu: 20 μl dung dòch muoãi nghieàn ñöôïc cho vaøo trong caùc gieáng rieâng bieät. Söû duïng bromua blue 1% vaø maùu ngöôøi toaøn phaàn laøm marker chuaån. - Chaïy ñieän di : Thôøi gian chaïy ñieän di laø 5 giôø, ôû nhieät ñoä 40C. 30 phuùt ñaàu: cöôøng ñoä 25 mA, hieäu ñieän theá 400V, 4 giôø 30 phuùt sau: cöôøng ñoä 40 mA, hieäu ñieän theá 400V - Nhuoäm baûn gel: Sau khi ñieän di seõ hình thaønh moät baûn gel khoâng maøu. Muoán nhaän bieát caùc saûn phaåm ñieän di phaûi söû duïng phöông phaùp nhuoäm ñaëc hieäu vôùi töøng loaïi enzyme. Caùc cô chaát, caùc coenzyme (NAD, NADP, NADH), caùc chaát 36 taïo maøu (NBT, Fast blue, Fast Garnet, Fast black, PMS) ñöôïc söû duïng cho caùc phaûn öùng nhuoäm maøu naøy. Toác ñoä chuyeån ñoäng töông ñoái (Rf) Ño khoaûng caùch töø ñieåm xuaát phaùt ñeán moãi baêng ñeå tính toác ñoä chuyeån ñoäng töông ñoái (Rf), laø tæ soá giöõa khoaûng caùch ño ñöôïc vaø khoaûng caùch chuyeån ñoäng töông öùng cuûa loaøi laáy laøm chuaån. Taàn soá allele - Tröôøng hôïp moät enzym coù 2 allele Taàn soá allele A ñöôïc tính theo coâng thöùc. n AaAApA 2 12 += Taàn soá allele a n Aaaaqa 2 12 += - Tröôøng hôïp moät enzym coù 3 allele Taàn soá allele A n AaAaAApA 2 112 1++= Taàn soá allele a n aaAaaaqa 2 112 1++= Taàn soá allele a 1 n aaAaaara 2 112 1111 1 ++= Trong ñoù: 37 - n: soá caù theå nghieân cöùu - AA: soá caù theå AA - aa : soá caù theå aa - a1a1: soá caù theå a1a1 3.5.3.6.Kyõ thuaät moå muoãi : Phöông phaùp cuûa Toå chöùc Y teá Theá giôùi (WHO),1975. Muïc ñích cuûa kyõ thuaät naøy laø tìm thoa truøng trong tuyeán nöôùc boït muoãi, tìm oocyste trong daï daøy muoãi, xaùc ñònh muoãi ñaõ ñeû hay chöa ñeû Caùc böôùc tieán haønh : Gaây meâ muoãi baèng ether hay chloroform, duøng kính luùp ñònh loaïi muoãi, xaùc ñònh sella muoãi. Cho leân lam kính 3 gioït nöôùc muoái sinh lyù 90/00 , moãi gioït caùch nhau 1,5 cm. Ñöa lam kính vaøo kính luùp 2 maét, muoãi ñöôïc ñaët vaøo gioït nöôùc ôû giöõa, ñaàu muoãi höôùng veà phía beân phaûi, buïng muoãi höôùng veà phía ngöôøi moå. Tay traùi ngöôøi moå muoãi caàm kim ñeø nheï leân ngöïc muoãi choã ñoâi chaân thöù 2, tay phaûi caàm kim ñaët nheï vaøo coå muoãi vaø keùo nheï, caùc tuyeán nöôùc boït theo ñaàu muoãi seõ ñöôïc loâi ra. Duøng kim caét caùc tuyeán nöôùc boït ra khoûi ñaàu vaø ñöa sang gioït nöôùc beân tay phaûi Duøng kim xeù raùch moät ít kitin ôû ñoát cuoái (ñoát 8). Ñaët kim phaûi leân treân ngöïc muoãi, kim traùi leân ñoát cuoái cuøng vaø keùo daàn kim sang phía traùi cho ñeán khi daï daøy vaø 2 buoàng tröùng ñöôïc loâi ra khoûi buïng muoãi. Vôùt xaùc muoãi ra khoûi lam kính. Taùch 2 buoàng tröùng sang gioït nöôùc beân traùi, daï daøy vaãn giöõ nguyeân ôû gioït nöôùc giöõa. Quan saùt tuyeán nöôùc boït ñeå tìm thoa truøng. Quan saùt daï daøy ñeå tìm oocyste. Quan saùt heä thoáng khí quaûn ôû buoàng tröùng muoãi ñeå phaân bieät muoãi ñaõ ñeû hay chöa ñeû. Muoãi chöa ñeû khí quaûn cuoän laïi thaønh töøng boù, muoãi ñaõ ñeû khí quaûn giaõn ra. 38 3.5.3.5. Kyõ thuaät ELISA phaùt hieän kyù sinh truøng soát reùt : Phöông phaùp Wirtz vaø coäng söï, 1985 Kyõ thuaät ELISA (Enzyme - Linked Immuno Sorbent Assays) ñöôïc phaùt minh naêm 1966, sau ñoù ñöôïc Wirtz vaø coäng söï phaùt trieån ñeå phaùt hieän khaùng nguyeân thoa truøng naêm 1985. Hieän nay kyõ thuaät ELISA ñöôïc söû duïng roäng raõi treân theá giôùi ñeå phaùt hieän kyù sinh truøng soát reùt trong cô theå muoãi. Nguyeân lyù cuûa phöông phaùp naøy laø öùng duïng phaûn öùng khaùng nguyeân - khaùng theå vaø phaûn öùng enzyme - cô chaát ñeå phaùt hieän KSTSR trong cô theå muoãi. Öu ñieåm cuûa phöông phaùp ELISA laø coù theå xöû lyù moät soá löôïng maãu lôùn, khoâng phaân bieät maãu soáng hay maãu cheát, xaùc ñònh chuûng loaïi vaø soá löôïng KSTSR. Quy trình ELISA - Ñóa goàm 96 gieáng(well), ñöôïc phuû baèng 50μl khaùng theå ñôn doøng Mab P.f2A10, Pv 210, Pv247, uû qua ñeâm ôû nhieät ñoä phoøng . - Dung dòch trong gieáng ñöôïc ñoå ra, 200 μl dung dòch blocking buffer ñöôïc cho vaøo, uû ôû nhieät ñoä phoøng trong moät giôø . - 50μl dung dòch muoãi nghieàn ñöôïc cho vaøo gieáng, chöùng döông vaø chöùng aâm ñöôïc cho vaøo caùc gieáng qui ñònh, uû ôû nhieät ñoä phoøng trong 2 giôø . - Röûa dóa 3 laàn baèng dung dòch PBS - Tween. Laøm khoâ. - 50 μl enzyme lieân keát khaùng theå (peroxidase- conjugated MAbs) cuûa P.f2A10, Pv 210, Pv247 ñöôïc cho vaøo caùc gieáng, uû ôû nhieät ñoä phoøng trong 1 giôø. - Röûa ñóa 3 laàn baèng dung dòch PBS - Tween. Laøm khoâ. - 100 μl cô chaát cuûa enzyme ñöôïc cho vaøo caùc gieáng. - Ñoïc keát quaû ôû maùy ñoïc ELISA, böôùc soùng 405 nm. Xöû lyù soá lieäu : Giaù trò ngöôõng (Cut off value) = Trung bình OD chöùng aâm + 3 SD 39 3.5.3.6. Kyõ thuaät thöû nhaïy khaùng: Phöông phaùp cuûa Toå chöùc Y teá Theá giôùi (WHO),1998 (WHO/CDS/CPC/MAL/98.12) Muïc ñích cuûa kyõ thuaät naøy laø xaùc ñònh moät loaøi muoãi nhaïy, taêng söùc chòu ñöïng, hoaëc khaùng vôùi moät loaïi hoaù chaát. Ñieàu kieän lyù töôûng cho thöû nghieäm laø muoãi caùi thöû nghieäm chöa huùt maùu, 1-2 ngaøy tuoåi, khoeû maïnh. Soá löôïng ít nhaát cho moät thöû nghieäm laø 150 caù theå. Nhieät ñoä phoøng thöû nghieäm : 25 ± 2°C, ñoä aåm töông ñoái 70 - 80 %. Quy trình thöû nghieäm - Chuaån bò caùc oáng nghæ : Loùt caùc tôø giaáy saïch vaøo beân trong oáng nghæ, duøng caùc voøng baèng theùp eùp giaáy saùt vaøo trong thaønh oáng. Cho töø 20 - 25 con muoãi ñaõ choïn vaøo 1 oáng nghæ. Ñeå muoãi nghæ 1 giôø, sau ñoù kieåm tra laïi vaø loaïi boû nhöõng con muoãi khoâng ñaït yeâu caàu, boå sung theâm muoãi cho ñuû soá löôïng. - Chuaån bò oáng ñoái chöùng vaø oáng thöû nghieäm: Loùt caùc tôø giaáy ñoái chöùng vaøo trong oáng ñoái chöùng vaø caùc tôø giaáy coù taåm hoaù chaát vaøo trong oáng thöû nghieäm. Duøng caùc voøng baèng kim loaïi eùp saùt tôø giaáy vaøo thaønh oáng. - Cho muoãi tieáp xuùc vôùi giaáy taåm hoaù chaát : Laép oáng nghæ vôùi oáng ñoái chöùng vaø oáng thöû nghieäm. Thoåi nheï ñeå chuyeån muoãi töø oáng nghæ sang oáng ñoái chöùng vaø oáng tieáp xuùc. Ñaët oáng tieáp xuùc coù muoãi theo chieàu thaúng ñöùng, thôøi gian tieáp xuùc 60 phuùt. Theo doõi ñeå nhieät ñoä vaø aåm ñoä ñaït yeâu caàu cuûa thöû nghieäm. - Quan saùt, ñeám, ghi soá löôïng muoãi ngaõ guïc (knock-down) vaøo caùc thôøi ñieåm 15, 30, 60 phuùt khi muoãi baét ñaàu tieáp xuùc vôùi hoaù chaát. - Chuyeån muoãi töø oáng ñoái chöùng vaø oáng thöû nghieäm sang oáng nghæ. Ñaët oáng thaúng ñöùng cho muoãi nghæ 24 giôø. Cho muoãi huùt nöôùc ñöôøng glucose 10%. Theo doõi nhieät ñoä vaø aåm ñoä trong thôøi gian naøy . 40 - Ñoïc keát quaû thöû nghieäm : Sau 24 giôø ñoïc keát quaû thöû nghieäm. Nhöõng con muoãi coøn bay ñöôïc tính laø muoãi soáng. • ÔÛ loâ ñoái chöùng - Tæ leä muoãi cheát > 20% : Keát quaû thöû nghieäm khoâng ñöôïc chaáp nhaän . Laøm laïi thöû nghieäm. - Tæ leä muoãi cheát 5 - 20 % : Keát quaû thöû nghieäm phaûi ñöôïc ñieàu chænh laïi theo coâng thöùc Abbott. - Tæ leä muoãi cheát < 5% : Keát quaû thöû nghieäm ñöôïc chaáp nhaän. • ÔÛ loâ thöû nghieäm - Tæ leä muoãi cheát töø 98 - 100% : Muoãi nhaïy vôùi hoaù chaát thöû nghieäm. - Tæ leä muoãi cheát töø 80 - 97 %: Muoãi taêng söùc chòu ñöïng vôùi hoaù chaát thöû nghieäm. - Tæ leä muoãi cheát < 80% : Muoãi khaùng vôùi hoaù chaát thöû nghieäm. Coâng thöùc Abbott: % MC thöïc teá = (% MC thöû nghieäm - % MC ñoái chöùng) x 100 100 - % MC ñoái chöùng 3.5.4.Thu thaäp vaø xöû lyù soá lieäu Soá lieäu ñieàu tra ñöôïc ñieàn vaøo caùc bieåu maãu thieát keá saün vaø xöû lyù theo phaàn meàm Epi-Info 6.0. So saùnh caùc tæ leä baèng pheùp thöû χ2. 41 Xaùc ñònh heä soá töông quan giöõa caùc yeáu toá moâi tröôøng (nhieät ñoä, ñoä aåm, löôïng möa) vôùi soá löôïng muoãi thu thaäp ñöôïc . Coâng thöùc tính heä soá töông quan r = 2222 )()( ))(()( EYEYEXEX EYEXXYE −− − - r = 0 : X vaø Y khoâng coù moái lieân heä tuyeán tính. - |r |≥ 0,7 : X vaø Y coù moái lieân heä chaët. - |r |= 0,5 – 0,7 : X vaø Y coù moái lieân heä trung bình. - |r |≤ 0,5 : X vaø Y coù moái lieân heä yeáu.